太平洋鱈發(fā)育早期干擾素通路相關(guān)基因的克隆分析及表達(dá)規(guī)律的研究.pdf

1、太平洋鱈（Gadus macrocephalus）是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)魚類。隨著海洋漁業(yè)的快速發(fā)展，太平洋鱈野生資源不斷下降，人工繁育亟待展開。本實(shí)驗(yàn)室太平洋鱈人工育苗技術(shù)日漸成熟，并在育苗過程中發(fā)現(xiàn)太平洋鱈在仔魚期出現(xiàn)大批量死亡現(xiàn)象。為探究這一現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)對干擾素系統(tǒng)的信號通路進(jìn)行初步研究，并通過對干擾素系統(tǒng)相關(guān)基因 TLR3， MDA5，IPS1，IRF3，IRF7和 ATG5基因的轉(zhuǎn)錄水平的測定來衡量干擾素系統(tǒng)在太平洋鱈早期發(fā)育中

2、的表達(dá)規(guī)律，為太平洋鱈人工育苗早期的疾病防治提供理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已獲得的轉(zhuǎn)錄組信息對TLR3，MDA5，IPS1，IRF3，IRF7和ATG5基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以太平洋鱈成魚的腎組織為實(shí)驗(yàn)材料，通過基因克隆測序，獲得目的基因片段。為探究干擾素系統(tǒng)在太平洋鱈早期發(fā)育中的作用特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)建立了絕對熒光定量PCR檢測方法，分別對6個(gè)目的基因在太平洋鱈各組織和太平洋鱈仔魚期中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了檢測。此外，本實(shí)驗(yàn)利用Poly(I:C)分別

3、對太平洋鱈2日齡和12日齡仔魚進(jìn)行浸泡，分別對目的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對相同基因的表達(dá)差異進(jìn)行了分析。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴太平洋鱈TLR3基因cDNA序列長3322bp，不包含完整閱讀框（Open reading frame， ORF)，序列中最長閱讀框編碼377個(gè)氨基酸。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中TLR3的表達(dá)水平結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為：y=-3.1475x+36.756R2=0.99

4、62；TLR3基因在太平洋鱈的各組織中均出現(xiàn)了表達(dá)，其中肝中TLR3的的表達(dá)量顯著高于其他組織，在心臟和胸腺中表達(dá)量其次，在鰓，腦和肌肉中表達(dá)量較少。⑵太平洋鱈MDA5基因cDNA序列長2604bp，不包含完整閱讀框，序列中最長閱讀框編碼844個(gè)氨基酸。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中MDA5的表達(dá)水平結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為：y=-3.2154x+36.154 R2=0.9949；MDA5基因在太平洋鱈的各

5、組織中均出現(xiàn)了表達(dá)，其中腎中MDA5的表達(dá)量顯著高于其他組織，在心臟，腸和脾中表達(dá)量其次，在腦和肌肉中表達(dá)量較少。⑶太平洋鱈ATG5序列長895bp，含有完整的開放閱讀框，編碼275個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)分子量約為32.2kDA。經(jīng)核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)，太平洋鱈 ATG5與半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)ATG5的相似性均高達(dá)87.27％。利用太平洋鱈與其

6、它物種 ATG5核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明 ATG5系統(tǒng)進(jìn)化樹反映的親緣關(guān)系基本符合傳統(tǒng)分類學(xué)觀點(diǎn)，氨基酸序列分析結(jié)果顯示了ATG5具有較高的保守性。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中ATG5的表達(dá)水平結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為：y=-2.8646X+31.989 R2=0.998；ATG5基因的轉(zhuǎn)錄在太平洋鱈的各組織中都有表達(dá)，肝、脾和腎表達(dá)量高于其他組織。⑷太平洋鱈IPS1基因cDNA序列長1539b

7、p，不包含完整閱讀框，序列中最長閱讀框編碼161個(gè)氨基酸。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中IPS1的表達(dá)水平結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為：y=-3.1287x+34.206 R2=0.9868其中腎和肝中IPS1的的表達(dá)量顯著高于其他組織，在胸腺，肌肉中表達(dá)量其次，在腦和鰓中表達(dá)量較少，其中在腦中的表達(dá)量最少。⑸太平洋鱈IRF3序列長1878bp，包含完整開放閱讀框，長1377bp，編碼459個(gè)氨基酸，其編碼的蛋

8、白質(zhì)分子量約為51kDa。經(jīng)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)太平洋鱈IRF3的氨基酸序列包括1個(gè)含有5個(gè)保守色氨酸殘基的DNA結(jié)合域(DNA binding domain, DBD)和1個(gè)保守的C端IRF關(guān)聯(lián)域（IRF association domain, IAD)；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明太平洋鱈IRF3與其他物種的IRF3親緣關(guān)系較近。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中IRF3的表達(dá)水平結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為：y=-3.3

9、449X+41.001 R2=0.9896；各組織絕對定量結(jié)果顯示性腺，肝和胸腺表達(dá)量高于其他組織。⑹太平洋鱈IRF7序列長為2032bp，包括一個(gè)38bp的5'UTR和一個(gè)668bp的3'UTR，含有完整ORF，長度為1323bp，編碼440個(gè)氨基酸，分子量約為50118Da，序列中含有一個(gè)polyA加尾信號(AATAAA)，5個(gè)mRNA不穩(wěn)定信號（ATTTA）；經(jīng)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)太平洋鱈IRF7 N端有個(gè)保守的DNA結(jié)合域，包含4

10、個(gè)保守的色氨酸(W)重復(fù)，C端具有一個(gè)較保守的IRF關(guān)聯(lián)域，羧基末端具有絲氨酸富含域（serine-rich domain SRD）；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明太平洋鱈 IRF7與大西洋鱈 IRF7親緣關(guān)系與進(jìn)化關(guān)系最近。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中IPS1的表達(dá)水平結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為：y=-3.2881x+43.399, R2=0.9904；各組織絕對定量結(jié)果顯示脾，腎和胸腺表達(dá)量高于其他組織。⑺實(shí)驗(yàn)通過