太平洋牡蠣類(lèi)FUT2基因的克隆與時(shí)空表達(dá).pdf

1、諾如病毒(Norovirus,NoV)是人類(lèi)急性病毒性腸胃炎的主要病原體,常引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生與食品安全事件。研究表明 NoV依靠識(shí)別組織血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)上的寡糖感染人體。太平洋牡蠣作為NoV感染人體的重要載體之一,體內(nèi)存在的類(lèi)A型組織血型抗原(A-like HBGA)能夠特異性富集NoV,并且富集NoV的含量存在季節(jié)性變化趨勢(shì),這種季節(jié)性變化趨勢(shì)是否由類(lèi)A型HBGA含量變化引

2、起,類(lèi) A型HBGA的合成關(guān)鍵基因是否影響其含量變化,目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以太平洋牡蠣類(lèi)A型HBGA合成途徑中的關(guān)鍵酶α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(類(lèi)FUT2)為研究對(duì)象,開(kāi)展了類(lèi)FUT2基因克隆與時(shí)空表達(dá)的研究,以期在分子水平上揭示太平洋牡蠣季節(jié)性富集NoV的機(jī)理。
　　本研究通過(guò)同源克隆的方法獲得太平洋牡蠣類(lèi) FUT2基因的 cDN A序列(GenBank登錄號(hào)KJ184342)。研究結(jié)果表明,太平洋牡蠣類(lèi)FUT2基因cDNA

3、全長(zhǎng)為1941 bp,包含180 bp的5'非翻譯區(qū)、編碼361個(gè)氨基酸的1086bp的開(kāi)放閱讀框以及675 bp的3'非翻譯區(qū)。分子進(jìn)化聚類(lèi)分析結(jié)果顯示,太平洋牡蠣類(lèi)FUT2基因與家鼠(Mus musculus)等哺乳動(dòng)物的FUT2基因聚為1個(gè)分支。
　　對(duì)太平洋牡蠣類(lèi) FUT2基因密碼子優(yōu)化后,構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pRSET-mof,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)終濃度為1.0 mmo l/L IPTG在37℃誘導(dǎo)4 h后表達(dá)產(chǎn)生目

4、的蛋白, SDS-PAG E檢測(cè)分析目的蛋白的表達(dá)狀況,并通過(guò)6×His-Tag標(biāo)簽的單克隆抗體和人類(lèi) FUT2的單克隆抗體分別進(jìn)行 western blotting檢測(cè)。結(jié)果顯示,類(lèi) FUT2基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功獲得表達(dá),表達(dá)產(chǎn)生的蛋白大小約為48 kDa(目的蛋白約為42 kDa,6×His-Tag約為6 kDa),與類(lèi)FUT2理論值(41.62 kDa)相符;并且可以與抗人類(lèi)FUT2的單克隆抗體結(jié)合。
　　針對(duì)太平洋

5、牡蠣類(lèi) FUT2基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR引物,采用SYBR Green染料法,以β-actin為內(nèi)參基因,基于Delta-Delta CT相對(duì)定量法,建立類(lèi)FUT2基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法,開(kāi)展類(lèi)FUT2基因表達(dá)量的分析,對(duì)該基因在牡蠣不同組織、不同季節(jié)的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行研究。結(jié)果表明,在牡蠣肝胰臟、閉殼肌、外套膜、唇瓣和鰓5個(gè)組織中均能檢測(cè)到類(lèi)FUT2基因mRN A的存在,且唇瓣中的表達(dá)量最低,其余4個(gè)組織

6、中的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P<0.01);6月份牡蠣各組織的類(lèi)FUT2基因的表達(dá)量均較低,在2~3月份呈下降趨勢(shì),在6~12月份呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),但在7~11月份的含量普遍都偏高。通過(guò)牡蠣類(lèi)A型HBGA的ELISA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)類(lèi)A型HBGA的含量在8月至次年5月的含量普遍較高,其中在1~3月份其含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),3~5月份呈現(xiàn)上升趨勢(shì),6~11月份總體處于上升趨勢(shì),而8~11月份均具有較高的含量。證實(shí)牡蠣類(lèi)FUT2基因mRNA的分布規(guī)律