牛γ干擾素基因克隆和表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、牛γ干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，作為生物藥劑和疫苗佐劑具有廣闊的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)成功地克隆、表達(dá)和純化了BoIFN-γ，并制備了兔抗BoIFN-γ的多克隆抗血清，為BoIFN-γ生物學(xué)特性及其應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。 本研究采用刀豆蛋白A刺激牛脾臟淋巴細(xì)胞總RNA，設(shè)計(jì)合成特異引物，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ReverseTranscriptase-PCR，RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增和克隆BoIFN-γ基因，與pMD1

2、8-T載體連接后進(jìn)行酶切、PCR以及序列測定和分析。結(jié)果表明，所克隆的BoIFN-γ基因全長498bp，編碼166個(gè)氨基酸，與GenBank發(fā)布的羊、豬、人、鼠和雞的IFN-γ核苷酸序列進(jìn)行比較，其同源率分別為81.3％、74.996、73.6％、53.7％和50.7％。與GenBank上發(fā)布的其它BoIFN-γ基因核苷酸序列進(jìn)行比較，其同源率為100％。將BoIFN-γ基因亞克隆到表達(dá)載體pET-30a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET

3、-BoIFN-γ并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，于37℃經(jīng)0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h，SDS-PAGE和Westernblot分析表明BoIFN-γ基因在大腸桿菌中獲得了高水平表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白以分子量約為25ku，且表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的35％。利用鎳離子親和樹脂進(jìn)行純化得到純化的目的蛋白濃度為1.6mg/ml，將純化蛋白免疫新西蘭白兔，制備了BoIFN-γ多克隆抗血清，經(jīng)瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和Westernblot鑒定證明所得到的多克