抗生殖支原體MgPa’重組蛋白單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、目的:將本試驗(yàn)室構(gòu)建的含生殖支原體黏附素( Mycoplasma genitalium adhesin protein,MgPa)蛋白優(yōu)勢(shì)表位基因(MgPa’3223~4092bp)的重組表達(dá)載體 pET-30a(+)/MgPa’在表達(dá)宿主菌 E.coliRosettaTM2(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行抗原性分析。應(yīng)用雜交瘤技術(shù),將SP2/0細(xì)胞與經(jīng)重組蛋白 MgPa’免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合,篩選抗重組蛋白 MgPa’

2、的單克隆抗體(mAb),并進(jìn)行鑒定和純化。由此初步確定該mAb的應(yīng)用價(jià)值,并為研制Mg感染診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。
　　方法:(1)采用鎳親和層析法純化重組蛋白MgPa’,并用SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。
　　(2)以純化復(fù)性后的MgPa’重組蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)篩選分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。
　　(3)體內(nèi)

3、誘生腹水法制備抗體,ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià),采用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA和Western-blot分析mAb的特異性,用mAb亞類測(cè)定試劑盒鑒定mAb的類別,用硫酸銨沉淀法對(duì)腹水中的mAb進(jìn)行純化。
　　結(jié)果:重組目的基因表達(dá)菌在IPTG的誘導(dǎo)下,表達(dá)了相對(duì)分子量(Mr)約為37kDa的目的蛋白,目的蛋白在菌體內(nèi)主要以包涵體形式存在;經(jīng)Ni-NTA親和層析法純化獲得了純度在95％以上的重組蛋白;應(yīng)用純化復(fù)性后的重組蛋白MgPa’免疫6~

4、8周齡的BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合;應(yīng)用ELISA法篩選出了6株分泌抗MgPa’重組蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為12E7、4B1、6E3、2B8、6E2和10E2;競(jìng)爭(zhēng)法ELISA或Western-blot分析結(jié)果顯示mAb均能與重組蛋白MgPa’很好的結(jié)合。用腹水誘生法大量制備mAb;ELISA檢測(cè)6株雜交瘤細(xì)胞誘生腹水中的mAb效價(jià)分別為1:25600、1:25600、1:12800、1:25600、1:2

5、5600和1:25600;經(jīng)Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit測(cè)定,6株雜交瘤細(xì)胞中12E7、4B1分泌的mAb為IgG2b,其它4株分泌的mAb均為IgG1。
　　結(jié)論:
　　(1)篩選出6株穩(wěn)定分泌抗MgPa’ mAb的雜交瘤細(xì)胞株,經(jīng)鑒定6株雜交瘤細(xì)胞分泌的mAb均能識(shí)別重組MgPa’。
　　(2)獲得的抗重組MgPa’的mAb均為IgG類抗體,且能識(shí)別MgPa’抗原的