豬肺炎支原體P97蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起豬氣喘病(MycoplasmaPneumoniaeofswine，MPS)的病原。MPS廣泛分布于世界各地，以接觸性、高度傳染性、慢性、高發(fā)病率和低死亡率為特點(diǎn)，由于Mhp能夠破壞呼吸道黏膜-纖毛屏障，從而繼發(fā)其他致病菌的感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病早期檢測(cè)比較困難以及缺乏特效的防治藥物，因此在疾病控制方面至今未能取得令人滿意的效果。 伴侶蛋白

2、Dnak是豬肺炎支原體的特異性外膜蛋白，伴侶蛋白Dnak的C端是其主要的抗原決定簇。P97蛋白是目前研究最為深入的Mhp表面的黏附因子，P97蛋白的C端也是其主要的抗原決定簇。本研究依據(jù)GenBank中公布的232株基因序列(AE017332)，以Mhp中國(guó)分離株Yin-1為模板利用合成的特異性引物，擴(kuò)增了DnaK基因的C末端，得到500bp的目的片段。擴(kuò)增了P97基因的C末端，得到670bp的目的片段。并將PCR產(chǎn)物分別克隆到pET-

3、30a載體上，經(jīng)PCR、酶切方法鑒定正確后，并送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的標(biāo)準(zhǔn)株yin-1株的DNA同源性為99％以上。鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)。獲得的重組蛋白分別命名為30a-DnakC-P97C和30a-P97C。經(jīng)超聲裂解，SDS-PAGE分析，重組蛋白均主要以可溶形式存在于上清液中，分別在57kD和36kD處分別獲得特異性條帶。經(jīng)Western-blot抗原性分析，均具有較好的免疫原性。

4、 利用Histag親和層析柱，對(duì)重組蛋白30a-DnakC-P97C和30a-P97C進(jìn)行分離純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示為單一蛋白條帶，純化效果較好。以30a-DnakC-P97C作為免疫抗原分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑乳化，免疫8周齡的雌性BALB/c小鼠，每只每次50μg，間隔兩周免疫一次，最后一次加強(qiáng)免疫不加佐劑，3d后，取免疫小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。以純化30a-P97C作為包被抗原

5、，用間接ELISA平行篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)有限稀釋法三次亞克隆后，獲得兩株針對(duì)P97的能穩(wěn)定分泌特定性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為A3C9和B4D5。生物學(xué)特性鑒定表明，腹水單抗A3C9和B4D5的間接ELISA效價(jià)分別為1∶105和1∶106，亞型鑒定分別為IgG2b和IgG2a亞類，且輕鏈均為k奎。相加ELISA試驗(yàn)表明，針對(duì)P97的兩株單抗識(shí)別的不是同一抗原表位。經(jīng)Western-blot分析表明，兩株單抗特異性地與豬肺支原體Yin