豬肺炎支原體伴侶蛋白DnaK單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是豬地方性肺炎(swineEnzooticPneumnoia，SEP)的病原體。SEP亦稱豬氣喘病(MycoplasmaPneumoniaeofswine，MPS)，廣泛分布于世界各地，以接觸性、高度傳染性、慢性、高發(fā)病率和低死亡率為特點(diǎn)。由于Mhp能夠破壞呼吸道黏膜-纖毛屏障而繼發(fā)其他致病菌的感染，使死亡率大大提高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于早期檢測(cè)的困難和缺

2、乏有效的藥物，在疾病控制方面至今未能達(dá)到滿意的效果。 伴侶蛋白Dnak是豬Mhp的特異性外膜蛋白，該蛋白C端的是其主要的抗原決定簇。本研究依據(jù)GenBank中公布的Yin-1基因序列，以豬Mhp中國(guó)分離株Yin-1為模板，利用所合成的特異性引物，擴(kuò)增DnaK基因的C末端，得到1000bp的目的片段。將該序列克隆到pMD-18-T載體上，經(jīng)PCR、酶切方法鑒定正確后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的Yin-1標(biāo)準(zhǔn)株的DNA比較，

3、二者同源性達(dá)99％以上。并將測(cè)序結(jié)果正確的片段分別克隆至表達(dá)載體pET-28a和pGEX-6P-1中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)。將所獲得的重組蛋白分別命名為6P-1-DnakC和28a-DnakC。經(jīng)超聲裂解，進(jìn)行SDS-PAGE分析，表明重組蛋白均主要以可溶形式存在于上清液中，在42kD和65kD處分別獲得特異性條帶。Western-blot抗原性分析結(jié)果表明二者均具有較好的免疫原性。 利用Histag親和層析柱

4、，對(duì)重組蛋白28a-DnakC進(jìn)行分離純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示為單一蛋白條帶，純化效果較好。以6P-1-DnakC作為免疫抗原分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑乳化，免疫8周齡的雌性BALB/C小鼠，每只每次500μg，間隔兩周免疫一次，最后一次加強(qiáng)免疫不加佐劑，5d后取免疫小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SF2/0進(jìn)行融合。以純化28a-DnakC作為包被抗原，用間接ELISA平行篩選陽性克隆，經(jīng)有限稀釋法三次亞克隆后

5、，獲得兩株能穩(wěn)定分泌特定性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1AD10和2AF11。生物學(xué)特性鑒定表明，腹水單抗1AD10、2AF11的間接ELISA效價(jià)分別為1:105和1:104，亞型鑒定分別為IgG2b和lgG2a亞類，且輕鏈均為k鏈。相加ELISA試驗(yàn)表明，兩株單抗識(shí)別不同的抗原表位。經(jīng)Western-blot分析表明，兩株單抗特異性的針對(duì)豬肺支原體Yin-1株65KD和42KD左右的抗原成分。而與其他相關(guān)支原體，如絲狀支原體絲狀亞