人載脂蛋白M重組蛋白和單克隆抗體的制備及其初步臨床應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　 人載脂蛋白M(apol ipoprotein M，apoM)是新發(fā)現(xiàn)的一種載脂蛋白，屬于疏水性分子結(jié)合蛋白家族，主要存在于HDL中。動(dòng)物和細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果表明，apoM通過(guò)參與前β-HDL的形成，促進(jìn)體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，同時(shí)還具抗炎和抗氧化的作用。因此，認(rèn)為apoM具有抗動(dòng)脈粥樣硬化功效，但其抗動(dòng)脈粥硬化作用機(jī)制目前還不十分清楚。由于apoM是一種小分子的載脂蛋白，分子量?jī)H24kD，且成熟分子中的疏水信號(hào)肽介導(dǎo)該

2、蛋白“錨著”在磷脂單層上，直接從血清中提取apoM蛋白較困難。本研究擬通過(guò)基因工程手段，體外表達(dá)apoM重組蛋白，而制備抗apoM的單克隆抗體，為apoM蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究打下基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 重組表達(dá)人全長(zhǎng)apoM蛋白并將其純化，得到濃度高、純度好的重組apoM蛋白。
　　 方法：
　　 利用人類肝臟cDNA文庫(kù)做模板，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增apoMDNA，將擴(kuò)增正確的目的基因片段插入

3、載體pET相應(yīng)位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E coli JM109進(jìn)行克隆，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行基因測(cè)序；再用測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌E. coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)；用親和純化的方法純化大腸桿菌表達(dá)的目的蛋白，并用SDS—PAGE凝膠電泳、Westren印跡及Lowry蛋白定量的方法對(duì)蛋白質(zhì)的含量、純度及特性進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 1、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)擴(kuò)增出一條特異的560bp的

4、基因片段，測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的人apoM基因序列完全一致。
　　 2、成功構(gòu)建了pET-apoM質(zhì)粒。經(jīng)BamH I和Xho I做雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)2條特異性的條帶，其中1條與酶切前質(zhì)粒位置相近，另1條與目的基因大小基本一致。
　　 3、含重組質(zhì)粒pET—apoM的大腸桿菌E. coli BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)重組蛋白，SDS—PAGE電泳分析表明在相對(duì)分子量34kD左右出現(xiàn)新的蛋

5、白條帶，與目的蛋白分子量一致。
　　 4、用親和層析的方法純化后的Trx-apoM重組蛋白，SDS-PAGE電泳表明純度高，無(wú)明顯雜帶。
　　 5、用抗Thioredoxin(Trx)抗體進(jìn)行Western印跡檢測(cè)證實(shí)，該重組蛋白為Thioredoxin(Trx)融合蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 本研究成功克隆出人apoM基因，并表達(dá)出Trx-apoM重組蛋白。通過(guò)克隆表達(dá)人apoM蛋白，一方面可以將其作為

6、抗原制備針對(duì)apoM的抗體，從而可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)人體血液中apoM含量的檢測(cè)試劑盒，為臨床研究和診斷提供工具；另一方面，可以對(duì)表達(dá)的apoM進(jìn)行理化處理，在細(xì)胞和動(dòng)物模型上對(duì)apoM的功能進(jìn)行研究，從而進(jìn)一步研究apoM在人體脂類代謝中的生理功能。
　　 背景：
　　 載脂蛋白M(apoM)由于其基因結(jié)構(gòu)和組織分布特點(diǎn)，被認(rèn)為其可在抗動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用；對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)及功能的認(rèn)識(shí)，有助于揭示其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制

7、，從而對(duì)疾病的預(yù)防及治療起著重要的推動(dòng)作用?？贵w作為研究工作中的探針，可以從分子、細(xì)胞和器官等不同水平上，研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；還能作為親合層析的配體，固定在層析柱上，通過(guò)親合層析從復(fù)雜的混和物中分離、純化某種蛋白，是蛋白質(zhì)功能研究的基本手段。利用雜交瘤技術(shù)制備抗體，是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域常用的方法；單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，便于人為處理和質(zhì)量控制，來(lái)源容易等特點(diǎn)，使它的應(yīng)用一直廣泛地受

8、到關(guān)注。血清中apoM蛋白分子量小，與脂蛋白結(jié)合緊密，物理方法不易分離，我們?cè)谇捌谘芯恐兄苽淞烁呒兌鹊闹亟MTrx—apoM蛋白，為單克隆抗體的制備提供了基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 制備親和力高、純度好的apoM單克隆抗體，并對(duì)抗體的濃度、免疫球蛋白亞類、相對(duì)親和力和特異性進(jìn)行分析鑒定。
　　 方法：
　　 用重組Trx—apoM蛋白免疫Ba1b/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選及克隆化，得到三株生長(zhǎng)良好，分泌穩(wěn)定

9、的雜交瘤細(xì)胞株；腹腔注射于Ba1/c小鼠，收取腹水，純化后得到三個(gè)抗apoM單克隆抗體。純化后的抗體經(jīng)12％SDS—PAGE電泳觀察純化效果；用抗體亞類測(cè)定試劑盒檢測(cè)單抗免疫球蛋白亞類；通過(guò)直接法ELISA相加試驗(yàn)判斷三株單克隆抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)；用直接ELISA法測(cè)定三株亞克隆抗體的相對(duì)親和力；用間接法ELISA阻斷試驗(yàn)判斷單克隆抗體的特異性；用免疫熒光和免疫組織化學(xué)的方法判斷單克隆抗體與細(xì)胞和組織的反應(yīng)特性；用Westren印跡法比

10、較單克隆抗體與重組Trx—apoM蛋白、人血漿蛋白的反應(yīng)。
　　 結(jié)果：
　　 1、得到了三株分泌穩(wěn)定、生長(zhǎng)良好的亞克隆雜交瘤細(xì)胞株。用該三株雜交瘤細(xì)胞接種小鼠得到的腹水單抗效價(jià)達(dá)到了1:106～1：107。
　　 2、經(jīng)亞型鑒定結(jié)果顯示三株mAb均為IgG2ak。
　　 3、1E2F12和8F12C6兩株單抗識(shí)別抗原的位點(diǎn)不同，1E2F12特異性結(jié)合的抗原位點(diǎn)也不同于14H187；同時(shí)結(jié)合抗原的能力1E

11、2F12/8F12C6強(qiáng)于1E2F12/14H1B7。
　　 4、三株單克隆抗體親和力由大到小次為1E2F12>8F12C6>14H1B7。
　　 5、阻斷試驗(yàn)顯示三株抗體均具有較好的特異性。
　　 6、Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組Trx—apoM蛋白與單克隆抗體的反應(yīng)情況，在約34kD處三株單抗均有特異性條帶，與預(yù)測(cè)的分子大小位置符合，背景清楚。
　　 7、與正常人肝細(xì)胞裂解液和混合人血清的Weste

12、rn印跡實(shí)驗(yàn)中，在分子量24kD處有特異性條帶出現(xiàn)。
　　 8、用制備的單抗檢測(cè)apoM在不同種屬細(xì)胞中的表達(dá)，表明在人正常肝細(xì)胞、猴腎細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)。
　　 9、用三株單克隆抗體檢測(cè)人組織中apoM蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在人肝組織細(xì)胞漿及人胰腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞漿、膜中呈陽(yáng)性表達(dá)，在心、肺、脾、大腸和小腸組織中未檢測(cè)到該蛋白的表達(dá)，符合率達(dá)100％。
　　 結(jié)論：
　　 成功制備了三株抗apoM的單克隆抗體，不

13、僅能與重組蛋白反應(yīng)，還可與人體內(nèi)的天然蛋白結(jié)合，是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道制備出了針對(duì)人血清天然apoM蛋白的鼠抗人單克隆抗體，為下一步定量檢測(cè)人血清中apoM蛋白含量打下了基礎(chǔ)。
　　 背景：
　　 apoM主要存在于HDL中，在肝臟和腎臟中表達(dá)，提示該蛋白與血脂的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝有關(guān)。最近Xu等發(fā)現(xiàn)血液中apoM濃度與體重指數(shù)(BMI)以及血液中瘦素(Leptin)含量呈正相關(guān)，而與血液中總膽固醇呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)機(jī)制還未明確。另外，a

14、poM屬于Lipocalin超家族，推測(cè)可能與血漿中疏水性生物活性分子的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝有關(guān)聯(lián)，其確切功能尚有待進(jìn)一步研究。目前國(guó)內(nèi)定量檢測(cè)apoM濃度的方法僅限于半定量的Western印跡和Dot-Blotting法，需要建立標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一、方法穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單的定量檢測(cè)方法，這對(duì)于臨床研究的深入進(jìn)行將有極大的幫助。
　　 目的：
　　 建立測(cè)定人血漿中apoM濃度的雙抗體夾心法，并對(duì)該方法的敏感性、重復(fù)性、抗干擾能力等作一評(píng)

15、價(jià)；并建立該方法的正常人參考范圍；觀察血漿中apoM與血脂之間的相關(guān)關(guān)系；初步比較正常人與冠心病各組人群之間血漿apoM濃度的變化趨勢(shì)。
　　 方法：
　　 用棋盤滴定法選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度；用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗apoM8F12C6抗體；用蛋白稀釋度曲線確定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍；用血漿稀釋度曲線確定實(shí)驗(yàn)中人血漿的稀釋倍數(shù)；確定了該方法的最低檢測(cè)限，測(cè)定批間、內(nèi)變異及非特異性脂蛋白的干擾，以觀察方法的敏感性

16、和特異性。通過(guò)測(cè)定124例健康體檢人群血漿apoM的濃度，建立本實(shí)驗(yàn)室的正常參考值范圍。比較穩(wěn)定型心絞痛組(SA)32例和急性冠脈綜合征組(ACS)34例病人與35例健康人群的血漿蛋白濃度，分析apoM在不同人群中的變化趨勢(shì)。
　　 結(jié)果：
　　 1、根據(jù)重組蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法的線性范圍為31.25～375ng/ml，最低檢測(cè)限為11.8ng/ml。批內(nèi)變異4.32～5.69％；批間變異5.24～5.83％。

17、>　　 2、血漿滴度曲線結(jié)果表明，人血漿在1：50到1：400范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，取線性范圍中間整數(shù)倍1：200稀釋度，作為實(shí)驗(yàn)中人血漿apoM濃度檢測(cè)的最佳稀釋倍數(shù)。
　　 3、不同濃度的脂蛋白apoAI、apoB及Lp(a)對(duì)該法干擾小，其測(cè)定的吸光度值均低于0.33，在該方法的線性范圍外。
　　 4、該方法的正常參考值范圍為13.15±2.68μg/ml。
　　 5、apoM與TG、TC及LDL-C呈負(fù)相

18、關(guān)趨勢(shì)，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與HDL-C、HDL-C/TC呈正相關(guān)(r=0.336和r=0.345)。
　　 6、兩組冠心病患者血漿apoM濃度(SA組11.02±1.96μg/ml，ACS組10.76±1.32μg/ml)均低于正常對(duì)照組(12.83±2.28μg/ml)，但兩組冠心病組之間濃度差異不明顯。
　　 結(jié)論：
　　 我們建立了測(cè)定人血漿中apoM的濃度的雙抗體夾心法，通過(guò)檢測(cè)該方法的敏感性、重復(fù)性