聚乙二醇-聚乙烯亞胺納米載體介導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦血管疾病嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，干細(xì)胞移植治療和基因治療是新興的治療策略和研究熱點(diǎn)。對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行體外基因修飾的核心問(wèn)題即選擇合適的基因載體，盡量滿(mǎn)足轉(zhuǎn)染效率高，制備程序簡(jiǎn)便，免疫原性和毒性低，易于配體修飾等要求。病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率較高而得以廣泛應(yīng)用，但構(gòu)建載體及轉(zhuǎn)染程序復(fù)雜，免疫原性大，靶向性差，使其臨床應(yīng)用受到極大限制。納米級(jí)非病毒基因載體陽(yáng)離子多聚物聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)的研究為基因治療指明了新的發(fā)展方

2、向。
　　 目的：
　　 制備聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物(Polyethylene glycol grafted polyethylenimine，PEG-PEI)并檢測(cè)其與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)的生物相容性。檢測(cè)PEG-PEI體外包裹質(zhì)粒的性能及其介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs的轉(zhuǎn)染效率，從而優(yōu)化可用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的N/P值范圍及最佳轉(zhuǎn)染效率所需的最適N/P值。
　　 方法：

3、
　　 PEG-PEI的制備由中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院完成。利用MTT比色法檢測(cè)PEG-PEI的細(xì)胞毒性，利用劃痕實(shí)驗(yàn)(Wound Healing)和干細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PEG-PEI對(duì)MSCs生物學(xué)特性的影響。
　　 利用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PEG-PEI包裹質(zhì)粒的能力，動(dòng)態(tài)光散射法(DynamicLight Scattering，DLS)測(cè)定PEG-PEI/DNA復(fù)合物粒徑，DNaseⅠ酶解實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PEG-PEI保護(hù)

4、質(zhì)粒免受酶解的能力。利用原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)觀(guān)察PEG-PEI/DNA復(fù)合物形態(tài)及其與MSCs表面的相互作用。設(shè)陽(yáng)離子脂質(zhì)體和HEK293T細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，配制不同N/P的PEG-PEI/DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。
　　 結(jié)果：
　　 當(dāng)完全培養(yǎng)基內(nèi)的PEG-PEI濃度低于14μg/ml(對(duì)應(yīng)于N/P40)，且與MSCs共孵育不超過(guò)8小

5、時(shí)時(shí)，MSCs存活率為97.5％，能遷移并占據(jù)約80％劃痕面積，在誘導(dǎo)條件下成功分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。PEG-PEI在N/P3時(shí)將質(zhì)粒完全包裹為電中性或略帶正電荷的復(fù)合物，但N/P10之后才足以保護(hù)質(zhì)粒免受DNaseⅠ的消化，并在大于N/P15時(shí)將PEG-PEI/DNA復(fù)合物粒徑壓縮至100-150 nm。
　　 PEG-PEI/DNA復(fù)合物吸附于MSCs膜表面后可能通過(guò)內(nèi)吞被攝入細(xì)胞。N/P40時(shí)PEG-PEI/DNA轉(zhuǎn)染

6、MSCs的效率為15-21％，略高于陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率8-15％。N/P大于40后轉(zhuǎn)染效率降至12％。
　　 結(jié)論：
　　 1.PEG-PEI具有良好的生物相容性，對(duì)MSCs的生物學(xué)特性沒(méi)有明顯影響。
　　 2.PEG-PEI能將質(zhì)粒包裹并壓縮形成電中性或略帶正電荷的納米顆粒，避免了DNaseⅠ消化，有利于質(zhì)粒吸附于細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)吞。
　　 3.PEG-PEI在最適N/P時(shí)獲得最佳轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染