聚乙烯亞胺-膽固醇結(jié)合脂質(zhì)微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)研究及應(yīng)用.pdf

1、基因治療是通過(guò)插入治療基因至病變細(xì)胞內(nèi)而產(chǎn)生特定功能的蛋白質(zhì)或抑制異?；虮磉_(dá),從而治療疾病的一種新方法。研究開(kāi)發(fā)安全、高效、靶向的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)是基因治療成功的關(guān)鍵,目前基因載體分為兩類:病毒載體和非病毒載體。非病毒載體因具有低免疫原性、能攜帶大分子量DNA及生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞。
　　 其中一種陽(yáng)離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI,Polyethyenimine)受到廣泛關(guān)注。PEI有線型或分枝狀結(jié)構(gòu),有較高的陽(yáng)性電荷,與帶

2、有陰性電荷的DNA或RNA結(jié)合能力較強(qiáng),所形成的復(fù)合物可粘附到細(xì)胞表面被細(xì)胞內(nèi)吞。PEI有很多質(zhì)子化的多級(jí)氨的氮原子,當(dāng)溶酶體內(nèi)的pH下降時(shí),PEI能夠大量捕獲質(zhì)子,并引起Cl-內(nèi)流,導(dǎo)致溶酶體滲透性腫脹,最后溶酶體破裂從而將內(nèi)吞的DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)(即質(zhì)子海綿效應(yīng)),DNA釋放后進(jìn)入細(xì)胞核中并表達(dá)。PEI的分子量的范圍變化很大,一般應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染載體的PEI的分子量在5000～25000Da。高分子量的PEI基因轉(zhuǎn)染效率很高,如分枝狀

3、PEI25KDa,但毒性也很大。低分子量PEI毒性很低,但一般而言其基因轉(zhuǎn)染效率很低,并且PEI作為基因轉(zhuǎn)染載體直接體內(nèi)應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞的聚集,可以與血液中的白蛋白等非特異性結(jié)合,導(dǎo)致聚合體的形成,體內(nèi)應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染效率低。
　　 所以需要對(duì)PEI進(jìn)行改性。改性PEI的目的主要是降低PEI的毒性,提高PEI和DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性,提高靶向性,減少與白蛋白的非特異性結(jié)合,延長(zhǎng)體內(nèi)的時(shí)間。
　　 研究目的:
　　 為了

4、探討不同分子量PEI接枝后性能和毒性的變化規(guī)律,本研究選擇低分子量和高分子量的PEI進(jìn)行膽固醇接枝,合成一系列的不同氨基接枝率的聚合物,研究其細(xì)胞毒性、DNA壓縮性、緩沖性、抗核酸酶降解性,從而篩選合適的聚乙烯亞胺-膽固醇脂質(zhì)聚合物；同時(shí)構(gòu)建具有抗蛋白沉淀作用的中性脂質(zhì)(聚乙二醇修飾)微泡,采用靜態(tài)自組裝技術(shù)把PEI-Chol/DNA復(fù)合物與脂質(zhì)微泡融合,形成脂質(zhì)微泡/PEI-Chol/DNA復(fù)合物,采用超聲定位達(dá)到靶向目的。最終構(gòu)建高

5、效低毒的聚乙烯亞胺-膽固醇(Polyethyleneimine cholesterol,PEI-Chol)結(jié)合脂質(zhì)微泡介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng),為臨床提供安全高效的給藥系統(tǒng)。
　　 研究方法和內(nèi)容:分四大部分
　　 第一部分 聚乙烯亞胺一膽固醇聚合物的合成、表征與性能測(cè)試
　　 用膽固醇甲酰氯連接聚乙烯亞胺的氨基形成PEI-Chol脂質(zhì)聚合物,分別用IR、1H-NMR、DSC對(duì)聚合物進(jìn)行表征；采用酸堿滴定法結(jié)合公式β=

6、dC(HCl)/dpH計(jì)算聚合物的緩沖容量；采用熒光探針?lè)y(cè)定聚合物的臨界膠束濃度(CMC)；并運(yùn)用MTT比色法測(cè)定不同分子量、不同接枝率聚合物的細(xì)胞毒性。
　　 第二部分 PEI-Chol/DNA復(fù)合物的制備及生物物理性能表征
　　 采用堿裂解法,通過(guò)制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、pEGFP-C1轉(zhuǎn)入和重組增殖、堿裂解法純化質(zhì)粒等工序,提取質(zhì)粒DNA；經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定大小及純度。采用激光粒度儀測(cè)定PEI及PEI-Chol與p

7、EGFP-C1所形成的復(fù)合物的粒徑、Zeta電位；瓊脂糖凝膠電泳法考察PEI-Chol與DNA的結(jié)合能力,及其對(duì)DNA在核酸酶Ⅰ作用下的保護(hù)作用,掃描電鏡觀察復(fù)合物的形態(tài)。
　　 第三部分 脂質(zhì)微泡/PEI-Chol/DNA自組裝系統(tǒng)的構(gòu)建和性能測(cè)試
　　 采用反相揮發(fā)法,結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-球面效應(yīng)法優(yōu)化脂質(zhì)微泡制備的條件。以微泡濃度為指標(biāo),探討PEI-Chol聚合物種類、融合溫度和融合時(shí)間對(duì)微泡濃度的影響,激光粒度儀測(cè)定微

8、泡復(fù)合物的粒徑和Zeta電位。并分別從超聲對(duì)裸DNA完整性、超聲對(duì)微泡完整性,超聲對(duì)細(xì)胞生存率的影響等方面考察脂質(zhì)微泡/PEI-Chol/DNA自組裝系統(tǒng)的安全性。
　　 第四部分 脂質(zhì)微泡/PEI-Chol/DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)
　　 研究了不同分子量PEI、PEI-Chol聚合物及其微泡介導(dǎo)的基因載體系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)染能力,通過(guò)以PEI-Chol(25-5)為對(duì)象,考察脂質(zhì)微泡融合溫度、融合時(shí)間、N/P比和

9、超聲時(shí)間對(duì)DNA轉(zhuǎn)染效果的影響,確立轉(zhuǎn)染條件,運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)定脂質(zhì)微泡/PEI-Chol/DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)在A549和MCF-7細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果。此外,通過(guò)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)和制備急性肺損傷(ALI)小鼠動(dòng)物模型,探討脂質(zhì)微泡/PEI-Chol/DNA轉(zhuǎn)染MIF siRNA對(duì)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.合成的PEI-Chol經(jīng)IR檢測(cè),圖譜上顯示PEI-Chol的羰基特征峰(1700cm-1),

10、表明聚乙烯亞胺與膽固醇成功連接,根據(jù)1H-NMR譜圖計(jì)算PEI的胺基接枝率,組成及分子量,達(dá)到試驗(yàn)預(yù)期效果,表明反應(yīng)可控。DSC圖譜顯示PEI連接膽固醇后剛性增強(qiáng)。
　　 2.同一分子量合成的PEI-Chol,其臨界膠束濃度(CMC)隨著膽固醇接枝量的增多,臨界膠束濃度逐漸下降。
　　 3.不同分子量的PEI,緩沖容量隨著分子量的增加而增大,同一分子量PEI合成的PEI-Chol,其緩沖容量隨著分子量的增加而減少。

11、>　　 4.聚合物對(duì)Hela、A549、MCF-7相對(duì)生長(zhǎng)率影響的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):低分子量PEI未表現(xiàn)出明顯毒性,隨著分子量的增大,細(xì)胞毒性增強(qiáng)。接枝膽固醇可明顯降低PEI的細(xì)胞毒性,且接枝膽固醇的量越多,PEI的細(xì)胞毒性降低越顯著。
　　 5.采用堿裂解法制備及純化后的pEGFP-Cl純度和大小合適,質(zhì)粒的A260/A280=1.89±0.025；分子量為4.7kb,濃度為279.37±0.971μg/ml。
　　 6

12、.低分子量PEI/DNA復(fù)合物的粒徑較大,接枝了膽固醇后壓縮DNA能力提高,抗酶能力增強(qiáng)；Zeta電位隨PEI分子量的增大而增大,接枝膽固醇可使Zeta電位下降；N/P越高,復(fù)合物的粒徑越小,Zeta電位增高。PEI-Chol與DNA能形成納米復(fù)合物。
　　 7.采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-球面效應(yīng)法制備的微泡較穩(wěn)定,能穩(wěn)定半個(gè)月,粒徑分布均勻,Zeta電位-8.3mV,最佳制備條件為DPPC(X1)=40mg,PEI-Chol(X2)=7.

13、5mg,DSPE-PEG2000(X3)=4.5mg。微泡濃度為8.22×109個(gè)/ml。
　　 8.采用PEI-Chol(1.8-1)和PEI-Chol(25-5)融合制成的微泡復(fù)合物的微泡濃度高于PEI-Chol(10-1)和PEI-Chol(25-1)融合制成的微泡濃度,另外PEI-Chol制備的微泡復(fù)合物的Zeta電位明顯低于PEI-Chol/DNA復(fù)合物。
　　 9.超聲頻率2MHz、120s條件下,MI在1.

14、0范圍內(nèi),對(duì)A549細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞的生存率以及DNA沒(méi)有有顯著影響,表明系統(tǒng)安全。
　　 10.轉(zhuǎn)染條件:融合溫度55℃,時(shí)間60min,超聲發(fā)射參數(shù):連續(xù)波,頻率2MHz,深度60mm,機(jī)械指數(shù)(mechanical index,MI)1.0,時(shí)間60s。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):接枝膽固醇明顯提升PET1.8K的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果,如結(jié)合脂質(zhì)微泡,轉(zhuǎn)染率和抗血清能力均有提高。
　　 11.成功構(gòu)建以LPS刺激引起的小鼠肺損傷

15、動(dòng)物模型,通過(guò)正常組、LPS刺激組,PC+LPS+MIF siRNA治療組(PEI-Chol轉(zhuǎn)染組)以及WP+LPS+MIF siRNA(微泡轉(zhuǎn)染組)等四組之間的對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)模型組肺組織病理變化明顯,而PC+LPS+MIF siRNA治療組無(wú)明顯的治療作用,而WP+LPS+MIF siRNA治療組能有效改善組織病理變化,并且能有效降低炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平,闡明本基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)是有效。
　　 結(jié)論:

16、r>　　 1.合成的PEI-Chol聚合物具有以下物理學(xué)特點(diǎn):合適的膽固醇接枝率對(duì)緩沖容量影響少,膽固醇基團(tuán)的引入可改變PEI的親水性和親油性,有助于膠束的形成。從而為選擇合適的接枝率的PEI-Chol提供依據(jù)。
　　 2.合成的PEI-Chol聚合物具有以下生理學(xué)特點(diǎn):接枝膽固醇可有效降低PEI的細(xì)胞毒性,并且能有效提高低分子量PEI對(duì)DNA的壓縮性能,提高其抗核酸酶作用,對(duì)DNA具有保護(hù)作用。
　　 3.以PEI-