聚乙二醇-聚乙烯亞胺-質(zhì)粒pEGFP-VEGF165納米膠束的制備及基因傳遞系統(tǒng)的優(yōu)化.pdf

1、本文聚乙二醇-聚乙烯亞胺/質(zhì)粒pEGFP-VEGF165納米膠束的制備及基因傳遞系統(tǒng)的優(yōu)化進(jìn)行了研究，文章主要探討了以下幾方面的內(nèi)容： (1)聚乙二醇．聚乙烯亞胺共聚物的合成與表征用親水的聚乙二醇對(duì)聚乙烯亞胺進(jìn)行改性，制備適用于基因轉(zhuǎn)染的非病毒類載體。以異佛爾酮二異氰酸酯活化聚乙二醇，再與聚乙烯亞胺反應(yīng)，兩步法合成了聚乙二醇．聚乙烯亞胺(PEG-PEI)嵌段共聚物，分別用IR、<'1>H-NMR．、GPC、DSC對(duì)共聚物進(jìn)行了表

2、征。在IR譜圖上可見(jiàn)mPEG—NCO中異氰酸基、及PEG．：PEI中脲基的特征峰；根據(jù)。H．NMR譜圖計(jì)算表明，此聚合反應(yīng)為可控反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)PEG與PEI的投料比例可控制共聚物組成及分子量；GPC曲線上共聚物為一單峰，與PEG和PEI均聚物峰位置不同，表明產(chǎn)物是．PEG-PEI共聚物，DSC分析也表明共聚物Tm較均聚物均有不同程度的下降，這是PEG和PEI兩種嵌段相互纏結(jié)的結(jié)果。因此證明成功合成了PEG-PEI共聚物。 (2)

3、聚合物緩沖容量的測(cè)定所有聚合物的緩沖容量用酸堿滴定的方法獲得，用0.1M鹽酸滴定標(biāo)準(zhǔn)液滴定，緩沖容量根據(jù)公式β=dc(HCl)/dpH計(jì)算。結(jié)果表明，分子量不同的PEI緩沖容量的最大值隨著分子量的增加而降低：同一分子量的PEI接枝不同量的PEG后，緩沖容量有明顯的下降，接枝PEG量越多，緩沖容量下降越大。值得注意的是，在生理pH4～7范圍內(nèi)，緩沖容量未見(jiàn)明顯差異。 (3)聚合物細(xì)胞毒性試驗(yàn)參照ISO10993和GB/T1688

4、6醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和要求，采用MTT法測(cè)定了不同聚合物的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，PEI的細(xì)胞毒性與分子量呈現(xiàn)正相關(guān)性，高分子量PEI的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)大于低分子量PEI的細(xì)胞毒性。PEI 2K在高濃度30μg/mL時(shí)幾乎未表現(xiàn)出明顯毒性，而分子量最大的PEI 750K即使在較低濃度10μg/mL時(shí)已表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，PEI 10K．和PEI 25K毒性居中。接枝PEG后可明顯降低聚合物的細(xì)胞毒性，接枝PEG的量越多，PEI的細(xì)胞毒性降低

5、越顯著。 (4)真核表達(dá)質(zhì)粒pEGF-VEGF165的構(gòu)建采用PCR技術(shù)，從原核表達(dá)質(zhì)粒PUC19-VEGF165中獲得上下游含有Hind Ⅲ和：BamH I酶切位點(diǎn)的目的基因VEGF165，與真核載體pEGFP-C1構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-vEGF165。通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)，帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-VEGF165構(gòu)建成功。 (5)聚合物/質(zhì)粒pEGFP-VEGF165復(fù)合物的自組裝對(duì)不同分

6、子量的PEI及PEG-PEI共聚物與質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物的凝膠阻滯試驗(yàn)、結(jié)合平衡試驗(yàn)研究表明，PEI 2K在N/P為5時(shí)仍不能完全與DNA結(jié)合，高分子量的PEI在較低的N/P比就能對(duì)DNA起到完全阻滯作用。接枝PEG側(cè)鏈后并未明顯影響PEI與DNA的結(jié)合能力。對(duì)DNA酶的穩(wěn)定性試驗(yàn)可以得出，形成復(fù)合物后可以保護(hù)DNA免受DNase I酶的降解，且聚合物與DNA完全結(jié)合的程度影響復(fù)合物對(duì)DNase I的穩(wěn)定性。 (6)聚合物/質(zhì)粒

7、pEGFP-VEGF165復(fù)合物的性能研究進(jìn)行了復(fù)合物的粒徑、Zeta電位、透射電鏡(TEM)和在水溶液中的溶解性的分析，結(jié)果表明，低分子量PEI與DNA形成復(fù)合物的粒徑明顯大于高分子量的：PEI，接枝了PEG后，PEG-PEI/DNA復(fù)合物的粒徑都明顯減小，接枝不同分子量的PEG對(duì)粒徑也有一定影響；Zeta電位隨PEl分子量的增大而增大，接枝分子量較大的PEG可使Zeta電位下降較多，復(fù)合物的粒徑和Zeta電位都與組成中的N/P有關(guān)。

8、接枝親水鏈段PEG對(duì)降低粒子間的聚集和增加溶解性起到了關(guān)鍵性的作用。 (7)聚合物/質(zhì)粒pEGFP-VEGF165復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)考察了PEI及PEG-PEI共聚物在HUVEC和VSMC兩種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率，結(jié)果表明，對(duì)于不同分子量的PEI在兩種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率，均為PEI 2K的轉(zhuǎn)染率最低，而PEI 25K的轉(zhuǎn)染率最高。接枝少量的PEG有利于提高轉(zhuǎn)染率，而接枝較多量的PEG轉(zhuǎn)染率明顯下降。轉(zhuǎn)染率先隨著N/P比的增加而增加到一

9、定值，N/P比繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)染率明顯下降。血清對(duì)聚合物/DNA復(fù)合物介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染有阻礙作用，而PEG化可減弱這種阻礙作用。 (8)PEG-PEI共聚物介導(dǎo)vEGF165基因轉(zhuǎn)染對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響以PEI及合成的PEG．PEI(2-25-1)共聚物，攜帶重組質(zhì)粒pEGFP-VEGF165基因轉(zhuǎn)染HUVEC，探討VEGF165的表達(dá)及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。ELISA檢測(cè)證明VEGF在細(xì)胞上清中有效表達(dá)，RT-PCR證明了VEGF1

10、65 mRNA水平上的有效表達(dá)且可有效地刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，PEG-PEI(2-25-1)為載體比PEI 25K轉(zhuǎn)染后可更有效的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。 綜上所述，通過(guò)考察不同的PEl分子量、PEG分子量、PEG接枝量得到一系列PEG-PEI共聚物，與pEGFP-VEGF165形成復(fù)合物，研究了復(fù)合物的各項(xiàng)物理化學(xué)性能和生物學(xué)性能，可知PEI的分子量、PEG的接枝量、PEI與DNA的結(jié)合比例(N/P)對(duì)聚合物/DNA復(fù)合物的各項(xiàng)性能都產(chǎn)