2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本研究合成了PEG-PEI共聚物作為非病毒基因載體,通過自組裝技術(shù)制備了聚合物/DNA復(fù)合物,考察了PEG的分子量、PEG的接枝量等因素對復(fù)合物的理化性質(zhì)、細胞轉(zhuǎn)染效率的影響,并將優(yōu)選出來的載體介導(dǎo)VEGF165基因轉(zhuǎn)染防治球囊損傷引起的再狹窄,為非病毒基因傳遞系統(tǒng)、再狹窄的基因治療提供實踐基礎(chǔ)和參考依據(jù)。本文主要探討了以下幾方面的內(nèi)容: (1)基因載體PEG-PEI的合成及表征以線形mPEG750、mPEG2000、mPEG5

2、000和支鏈型PE125K為原料,用IPDI作為偶聯(lián)劑,在DBTL,作為催化劑的反應(yīng)條件下,通過兩步反應(yīng)合成了一系列PEG-PEI接枝共聚物,并通過FT-IR、1H NMR、GPC對共聚產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)表征,確認生成了PEG-PEI共聚物,通過1H NMR計算出共聚物的分子量,并通過GPC測定了共聚物的分子量及分布。 (2)基因載體PEG-PEI的生物學(xué)性能通過光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)、MTT比色法測定細胞活力的方法測定PEI及PEG

3、-PEI的體外細胞毒性,結(jié)果表明,PEI進行PEG化修飾后,可降低細胞毒性,且隨著PEG接枝量的增加,毒性逐漸減小;PEG接枝量相同時,PEG對毒性的改善作用與PEG分子鏈的長短有關(guān),接枝PEG的分子鏈越長,共聚物的毒性越小。聚合物與DNA結(jié)合后,毒性進一步降低。而PEG與PEI進行簡單的混合并不能達到共聚物的效果。通過溶血試驗、紅細胞聚集試驗來評價PEI及PEG-PEI的生物相容性,結(jié)果表明,聚合物的溶血作用隨著濃度的增大而增大,PE

4、I在進行PEG修飾后,溶血作用有一定程度的減小,PEG的接枝量越大,溶血作用減小得越多,在高濃度時這種效果更為明顯。聚合物引起的紅細胞聚集隨著聚合物濃度的增大而增強,與PEI相比,PEG-PEI引起紅細胞聚集的程度有所減輕,并且PEG的接枝量越大,引起紅細胞聚集的程度越輕微,但對于分子量較小的PEG750來說,效果沒有PEG2000、PEG5000的好。 通過測定PEI及PEG-PEI的pH滴定曲線來計算PEG-PEI共聚物的緩

5、沖容量,發(fā)現(xiàn)在進行PEG化修飾后,PEI的緩沖容量有所下降,且PEG接枝量越多,緩沖容量下降得越多,與伯胺基相對應(yīng)的pKa 1和β 1均有不同程度的下降,而與仲胺基相對應(yīng)的pKa2和β 2基本沒有受到影響。但在生理pH值范圍內(nèi),PEG-PEI的緩沖容量沒有受到明顯的影響。 (3)基因傳遞系統(tǒng)的自組裝及性質(zhì)研究通過瓊脂糖凝膠電泳阻滯試驗檢驗了PEI及PEG-PEI結(jié)合DNA的能力,PEG接枝量較少時PEG-PEI結(jié)合DNA的能力沒

6、有受到明顯影響,當PEG接枝量為50%時,PEG-PEI結(jié)合DNA的能力有所下降。 通過肝素釋放DNA的試驗考察了聚合物與DNA結(jié)合的牢固程度,PEG接枝量較少的PEG-PEI與DNA的結(jié)合強度和PEI相似,當PEG接枝量為50%時,PEG-PEI與DNA的結(jié)合強度有所減弱。 通過比較不同聚合物/DNA復(fù)合物的粒徑和Zeta電位數(shù)據(jù),探討影響復(fù)合物物理穩(wěn)定性的因素。聚合物/DNA復(fù)合物納米粒的粒徑隨著N/P比增大而減小,

7、PEI與DNA形成的復(fù)合物粒徑較大,是由較小的納米粒聚結(jié)而成,并且這種聚結(jié)是由磷酸根離子引起的。PEG-PEI與DNA形成的復(fù)合物納米粒,由于PEG的空間排斥作用,防止了納米粒的聚結(jié),粒徑顯著減小。PEG與PEI的簡單混合并不能提供有效的空間排斥作用。PEG可以有效地屏蔽PEI的正電荷,使得PEG-PEI/DNA復(fù)合物的Zeta電位比PEI/DNA復(fù)合物的顯著減小。復(fù)合物的Zeta電位還與溶液中的離子種類和離子強度有關(guān),在富含磷酸根離子

8、的介質(zhì)中,所有復(fù)合物的Zeta電位均可降低至負值。PEG-PEI/DNA復(fù)合物比PEI/DNA復(fù)合物有更好的沉降穩(wěn)定性,小粒徑并不是維持納米粒穩(wěn)定的主要原因,PEG的空間穩(wěn)定作用更為重要。通過酶降解試驗、超聲降解試驗來考察復(fù)合物對DNA的保護作用。PEI、PEG-PEI與DNA形成復(fù)合物后均可以保護DNA不被核酸酶降解,且可以抵抗超聲作用對DNA分子的破壞。 (4)基因傳遞系統(tǒng)的體外細胞轉(zhuǎn)染試驗以PEI25K為載體系統(tǒng),考察了N

9、/P比、自組裝介質(zhì)對PEI/DNA復(fù)合物的體外細胞轉(zhuǎn)染效率的影響。PEI/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率隨N/P比的增加而增加,但N/P比過大時,由于PEI的毒性,轉(zhuǎn)染率反而下降,最佳的N/P比為10。在較低pH值的介質(zhì)中組裝的PEI/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染率有所下降,而在葡萄糖溶液中組裝的PEUDNA復(fù)合物幾乎沒有轉(zhuǎn)染作用。 用中性磷脂對PEUDNA復(fù)合物進行物理包覆,希望利用磷脂與細胞膜的親和性來提高轉(zhuǎn)染效率。PEUDNA復(fù)合物經(jīng)磷脂包覆

10、后,對轉(zhuǎn)染效率有一定的改善,但提高的幅度不大,且磷脂包覆的PEI/DNA復(fù)合物穩(wěn)定性較差,易重新分離為磷脂囊泡和PEI/DNA復(fù)合物。 PEG-PEI的毒性比PEI小,所以可以使用更高的N/P比,因此轉(zhuǎn)染效率更高,但PEG的接枝量過多時,由于屏蔽作用過大,轉(zhuǎn)染率反而下降。血清對聚合物/DNA復(fù)合物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染有阻礙作用,而PEG化修飾后可以減小這種阻礙作用。 通過熒光顯微鏡觀察分析細胞轉(zhuǎn)染過程,發(fā)現(xiàn)復(fù)合物穿過細胞膜并非

11、轉(zhuǎn)染過程的限制性步驟,而復(fù)合物從內(nèi)吞體/溶酶體中釋放出來則可能是轉(zhuǎn)染過程的一個限制性步驟。 通過ELISA試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后細胞上清液中VEGF蛋白的表達水平,結(jié)果表明,pEGFP-VEGF165質(zhì)粒在Hela細胞中能夠成功表達出具有治療作用的VEGF蛋白,且VEGF蛋白的表達量與GFP的總熒光強度tFI之間有一定的線性關(guān)系,提示可以用tFI代替VEGF蛋白表達量作為評價轉(zhuǎn)染效率的指標。 (5)基因傳遞系統(tǒng)對家兔血管再狹窄

12、的防治作用建立了家兔頸總動脈球囊損傷的動物模型,以PEI和PEG-PEI介導(dǎo)質(zhì)粒pEGFP-VEGF165在損傷的局部血管腔內(nèi)轉(zhuǎn)染,14天后取材進行病理切片分析血管再狹窄的程度,用掃描電鏡觀察血管內(nèi)皮的修復(fù)情況,通過RT-PCR檢測血管壁組織中VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄情況。PEI治療組全部出現(xiàn)栓塞,表明PEI在本實驗的用量下不適宜用于體內(nèi)治療。PEG-PEI治療組比鹽水對照組的內(nèi)皮修復(fù)較完全,內(nèi)膜增生程度、管腔狹窄程度比鹽水對照組顯著減輕

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