肝靶向性半乳糖-聚乙二醇-聚乙烯亞胺納米載體介導(dǎo)siRNA質(zhì)粒干擾HepG2細(xì)胞HLA-E基因表達(dá)的體外研究.pdf

1、肝移植是治療原發(fā)性肝癌的有效手段，肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)影響其長期療效，但目前臨床治療方法效果均不理想，免疫治療可能成為新的治療模式。 NK細(xì)胞(naturalkiller，NK)是機(jī)體天然免疫的核心細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有先天識(shí)別作用，在細(xì)胞因子的激活下能溶解低水平HLA—I的自體或異體腫瘤細(xì)胞，控制腫瘤的生長速度并防止其傳播擴(kuò)散，甚至引起部分轉(zhuǎn)移瘤的消退，延長生存時(shí)間。 多數(shù)腫瘤細(xì)胞經(jīng)典HLA—I類分子表達(dá)下調(diào)，非經(jīng)典HLA

2、—I類分子異常表達(dá)，NK細(xì)胞的抑制受體CD94/NKG2-A、NKG2-B與非經(jīng)典HLA—I類分子HLA—E/G結(jié)合，抑制了NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的溶解作用，可能是腫瘤細(xì)胞逃避NK細(xì)胞免疫監(jiān)視的一個(gè)新機(jī)制，封閉其抑制性受體CD94/NKG2則可提高NK細(xì)胞的抗腫瘤作用。 人類白細(xì)胞抗原—E(HLA—E)是功能和作用途徑較為明確的主要非經(jīng)典HLA—I類分子，是免疫細(xì)胞表面的抑制性受體CD94/NKG的主要配體。HLA—E將絕大多數(shù)HL

3、A—I類源性的引導(dǎo)肽呈遞給NK細(xì)胞的受體，通過CD94/NKG2受體調(diào)控NK細(xì)胞的功能，抑制NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。若能有效下調(diào)腫瘤HLA—E基因的表達(dá)，可抑制其通過CD94/NKG2等受體的抑制信號(hào)傳遞，提高機(jī)體NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用，但不會(huì)特別影響正常細(xì)胞的免疫功能。 RNA干擾技術(shù)(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉

4、默(post—transcriptionalgenesilencing)過程，通過siRNA形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA—inducedsilencingcomplex)，識(shí)別靶mRNA并使其特異性降解，從而使該基因表達(dá)沉默，抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)。 由于RNAi主要是發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，因此外源性的siRNA或者shRNA必須穿過細(xì)胞膜，在胞質(zhì)內(nèi)達(dá)到足夠濃度才能發(fā)揮阻抑效應(yīng)，而目前的轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)方式如病毒載體等都存在相應(yīng)的缺點(diǎn)，

5、臨床應(yīng)用價(jià)值不大。 陽離子多聚物聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是目前常用的納米基因載體，具有相對(duì)較高的轉(zhuǎn)染效率。但PEI具有一定的細(xì)胞毒性，原因在于大分子量PEI在細(xì)胞內(nèi)聚集而產(chǎn)生高密度的陽離子電荷。聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)修飾可屏蔽PEI密度過高的正電荷，從而降低其細(xì)胞毒性。但PEG修飾后的PEI與核酸形成的復(fù)合物顆粒較大，不利于細(xì)胞攝取，對(duì)PEG—PEI進(jìn)行靶向性修飾可

6、提高對(duì)特定細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。在納米基因載體的表面偶聯(lián)靶細(xì)胞的配體或抗體，通過靶向性分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)基因治療的主動(dòng)靶向性。肝細(xì)胞表面擁有豐富的去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoproteinreceptor，ASGR)，能與有半乳糖末端的去唾液酸糖蛋白結(jié)合并內(nèi)化，因此對(duì)納米載體進(jìn)行特異性半乳糖改性修飾，可使其具有肝細(xì)胞靶向性。靶向性基因載體可有效提高基因傳遞的特異性，降低治療副作用。 利用肝細(xì)胞靶向性納米

7、基因載體介導(dǎo)siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，可有效下調(diào)肝癌細(xì)胞HLA—E的表達(dá)，提高機(jī)體NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，增強(qiáng)機(jī)體的免疫細(xì)胞監(jiān)視功能，而不干擾機(jī)體免疫系統(tǒng)功能。 本研究通過合成肝細(xì)胞靶向性納米基因載體半乳糖—聚乙二醇—聚乙烯亞胺(galactosylatedpoly(ethyleneglycol)—graft—polyethylenimine，Gal—PEG—PEI)并考察其基本理化性能，并利用其為載體介導(dǎo)psiRNA轉(zhuǎn)

8、染肝癌細(xì)胞系HepG2，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及相關(guān)影響因素，并對(duì)其體外干擾HepG2細(xì)胞HLA—E基因表達(dá)的效果及機(jī)制進(jìn)行分析，為肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)防和治療提供新的途徑。 方法: 1.兩步法合成Gal—PEG—PEI，提取質(zhì)粒，按不同的N/P(Gal—PEG—PEI中氨基與psiRNA磷酸基比例)合成Gal—PEG—PEI/psiRNA納米粒。用1H—NMR、激光衍射納米粒度分析儀、透射電鏡、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、EB結(jié)合殘余D

9、NA實(shí)驗(yàn)、DNaseⅠ酶消化、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)其理化性質(zhì)。 2.Gal—PEG—PEI介導(dǎo)psiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，24h后，用倒置熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染48h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；測(cè)定半乳糖競(jìng)爭拮抗效果及血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系BEL—7402、人肝癌細(xì)胞系SSMC—7721、人胎肝細(xì)胞系L—02及胚腎細(xì)胞系A(chǔ)D293細(xì)胞并測(cè)定其轉(zhuǎn)染效率。 3.分別用裸

10、psiRNA、PEG—PEI/psiRNA、Gal—PEG—PEI/NC—psiRNA、Gal—PEG—PEI/psiRNA、Lipofectamine2000/psiRNA轉(zhuǎn)染HepG2，RealtimeRT—PCR檢測(cè)細(xì)胞的HLA—EmRNA表達(dá)水平，Westernblot檢測(cè)HLA—E蛋白水平。 結(jié)果: 1.Gal—PEG—PEI的1H—NMR圖譜分析表明Gal是PEI的氨基的0.2mol％。 2.隨N/P

11、的不斷增大，Gal—PEG—PEI/psiRNA納米復(fù)合物的粒徑逐漸減小，分布范圍變窄，最小粒徑為81.1±1.0nm。Zeta電位則隨著N/P的增大而逐漸上升。 3.透射電鏡觀察，N/P=8時(shí)，Gal—PEG—PEI/psiRNA納米復(fù)合物平均粒徑為62.93±27.16nm。 4.EB結(jié)合殘余psiRNA實(shí)驗(yàn)表明Gal—PEG—PEI對(duì)psiRNA的包覆效率高于PEG—PEI和PEI。 5.DNaseⅠ酶消化

12、實(shí)驗(yàn)表明納米復(fù)合體對(duì)psiRNA有一定的保護(hù)作用，而裸psiRNA在相同條件下則被完全降解。 6.Gal—PEG—PEI的細(xì)胞毒性和PEG—PEI無明顯差別(P>0.05)，而明顯低于PEI(P<0.01)。 7.Gal—PEG—PEI組、PEG—PEI組轉(zhuǎn)染HepG2的效率隨N/P的增加而增強(qiáng)，在N/P=8時(shí)，Gal—PEG—PEI組取得最高轉(zhuǎn)染效率(37.34±2.45)％，在N/P=7時(shí)，PEG—PEI組取得最高轉(zhuǎn)

13、染效率(12.45±0.89)％，之后隨N/P的增加而轉(zhuǎn)染效率逐漸減弱；Gal—PEG—PEI組的最高轉(zhuǎn)染效率顯著高于PEG—PEI組、Lipofectamine2000組(29.09±1.78)和裸psiRNA組(0.52±0.23)％(P＜0.01)；加入半乳糖后，Gal—PEG—PEI組的轉(zhuǎn)染效率為(3.6±1.22)％，顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。PEG—PEI組、Lipofectamine2000組的轉(zhuǎn)染效率分別為(12.

14、15±0.53)％、(26.4±5.12)％，與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；Gal—PEG—PEI組、PEG—PEI組和Lipofectamine2000組在轉(zhuǎn)染媒介中血清存在時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率分別為(14.18±0.67)％、(6.13±2.41)％和(9.78±1.53)％，與Opti—MEM組相比均呈顯著下降(P＜0.01)。 8.Gal—PEG—PEI介導(dǎo)psiRNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系BEL—7402、人肝癌細(xì)胞系

15、SSMC—7721細(xì)胞、人胎肝細(xì)胞系L—02，Gal—PEG—PEI組的轉(zhuǎn)染效率均顯著高于PEG—PEI組(P＜0.05)；加入半乳糖后，PEG—PEI組的轉(zhuǎn)染效率無明顯變化，而Gal—PEG—PEI組的轉(zhuǎn)染效率顯著降低(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染胚腎細(xì)胞系A(chǔ)D293細(xì)胞后，Gal—PEG—PEI組的轉(zhuǎn)染效率與PEG—PEI組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，加入半乳糖后二者的轉(zhuǎn)染效率無明顯變化(P＞0.05)。 9.Gal—PEG—PE

16、I/psiRNA在轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC—7721、BEL—7402及正常胎肝細(xì)胞系L—02和胚腎細(xì)胞系A(chǔ)D293時(shí)，各細(xì)胞間的轉(zhuǎn)染效率具有顯著性差異(P＜0.01)。 10.轉(zhuǎn)染HepG2后48h，陰性對(duì)照組、PEG—PEI組、Lipofectamine2000組、Gal—PEG—PEI組的HLA—EmRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.01±0.05、1.03±0.1、0.87±0.03、0.55±0.02、0.45±0

17、.03。Gal—PEG—PEI介導(dǎo)psiRNA干擾HLA—EmRNA的效率顯著高于Lipofectamine2000、PEG—PEI和裸psiRNA(P＜0.01)，其干擾作用可持續(xù)7天。Westernblot檢測(cè)HLA—E蛋白水平的結(jié)果與RealtimeRT—PCR相符。 結(jié)論: 1.成功合成納米基因載體Gal—PEG—PEI。 2.Gal—PEG—PEI的細(xì)胞毒性較低，與psiRNA有較高的結(jié)合效率并對(duì)其有一