葡聚糖—阿霉素—聚乙烯亞胺納米載體介導RNA干擾沉默Livin基因在骨肉瘤中的作用研究.pdf

1、目的：
　　骨肉瘤是臨床常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一，約占所有骨腫瘤的20％，多見于青少年，惡性程度高，易復發(fā)和轉移，預后較差。Livin是近年來發(fā)現(xiàn)的人凋亡抑制蛋白家族的新成員，某些實體腫瘤組織中存在特異性的表達，能抑制多種凋亡刺激因素所誘發(fā)的細胞凋亡。胎盤生長因子(Placerltal growth factor，PlGF)是屬于VEGF家族的糖蛋白，在腫瘤等病理性血管生成和調控中發(fā)揮著極為重要的作用。PlGF作為調節(jié)新生血管生

2、成的相關因子在骨肉瘤中表達狀況的研究目前尚無報道。本實驗的第一部分主要研究Livin及PlGF蛋白在骨肉瘤組織和正常骨組織中的表達差異以及該兩種蛋白在骨肉瘤組織中陽性表達之間的相關性，分析兩者在骨肉瘤的臨床診斷及治療中的意義。該部分研究的另一目的是研究Livin及PlGF mRNA在骨肉瘤MG-63、Saos-2以及U2-OS細胞株中的表達差異，分析其與細胞分化成熟程度之間的關系；第二部分主要研究制備葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因載

3、體，并對其生化特性、粒徑、形態(tài)等相關性質進行表征。研究該納米基因載體對骨肉瘤MG-63和Saos-2細胞增殖的抑制作用；第三部分研究構建Livin-shRNA的真核表達載體，獲得Livin-shRNA質粒穩(wěn)定轉染的骨肉瘤MG-63細胞，應用上述實驗制備的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因載體將阿霉素和Livin-shRNA質粒同時轉入骨肉瘤MG-63和Saos-2細胞中并優(yōu)化轉染效率，研究該納米載體介導的化療聯(lián)合基因治療在骨肉瘤中的綜合

4、作用。為進一步研究納米載體、基因治療以及綜合治療在骨肉瘤中的作用機制進行探索。
　　方法：
　　第一部分：研究Livin及PlGF在骨肉瘤組織和不同骨肉瘤細胞株中的表達差異以及該兩種因子在骨肉瘤中陽性表達的相關性，分析兩者在骨肉瘤的臨床診斷及治療中的意義；選取我院骨科在2003年至2008年之間行活檢或手術切除的57例骨肉瘤組織標本和10例正常骨組織標本。應用免疫組織化學染色法檢測Livin和PlGF蛋白在骨肉瘤組織和正常骨

5、組織標本中的表達，根據(jù)陽性細胞百分比和染色強弱綜合判斷兩種蛋白的表達水平，并分析兩者陽性表達之間的相關性及與骨肉瘤各項臨床病理指標之間的相關性。應用Real-time PCR檢測Livin和PlGF mRNA在骨肉瘤MG-63細胞、Saos-2細胞及U2-OS細胞中的表達，研究其在不同細胞株中的表達差異。
　　第二部分：制備葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因載體并對其進行表征。通過兩步法合成葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因載體，

6、優(yōu)化制備條件。首先，由于高碘酸鈉引發(fā)的氧化反應，葡聚糖T40被氧化產生醛基。鹽酸羥胺滴定法測定氧化葡聚糖的氧化程度和醛基含量，紅外光譜及紫外光譜分析對氧化葡聚糖的結構進行表征，水相凝膠滲透色譜儀測定氧化葡聚糖的分子量。其次，阿霉素及聚乙烯亞胺分子中的游離氨基通過雪夫式堿(Skiff base)的形式結合到氧化葡聚糖的醛基上，應用硼氫化鈉促使該反應產物形成穩(wěn)定的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因載體。采用紫外分光光度法測定該納米基因載體中

7、偶合阿霉素的含量和載藥率。應用紫外光譜、紅外光譜以及核磁共振分析對其結構進行表征，應用透射電鏡觀察該納米載體的形態(tài)及大小，應用馬爾文激光粒度儀測定納米載體的粒徑和表面電位。利用該納米載體上的氨基與DNA的磷酸根基團通過靜電吸附作用形成穩(wěn)定的納米基因復合物，應用透射電鏡觀察其形態(tài)和大小，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測該納米基因載體對DNA的縮合能力，激光粒度儀測定其粒徑和表面電位。MTT細胞毒性實驗分別測定阿霉素、葡聚糖-聚乙烯亞胺共聚物以及葡聚

8、糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體對骨肉瘤MG-63和Saos-2細胞的增殖抑制作用。
　　第三部分：研究葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體介導的化療聯(lián)合基因治療在骨肉瘤中的綜合作用。合成Livin基因干擾序列并定向插入到RNA干擾(RNAi)真核表達載體pGenesil-1質粒，通過測序進行鑒定。干擾質粒經脂質體Lipofectamine2000介導轉染骨肉瘤MG-63細胞，經G-418持續(xù)篩選獲得穩(wěn)定轉染Livin shRNA的細

9、胞系。Real-timePCR和Western blot分別檢測穩(wěn)定轉染細胞中Livin mRNA和蛋白的表達，驗證Livin-shRNA真核表達質粒在骨肉瘤MG-63細胞中對Livin的基因沉默效果。應用上述實驗制備的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因將Livin shRNA質粒轉入骨肉瘤MG-63和Saos-2細胞中并優(yōu)化轉染條件(以攜帶相同Livin shRNA質粒的脂質體載體以及PEI25K載體為陽性對照)。倒置熒光顯微鏡觀察轉

10、染前后骨肉瘤細胞的形態(tài)學改變以及轉染后綠色熒光蛋白的表達，流式細胞術測定該納米載體對Livin shRNA表達質粒的轉染效率，并分析其與脂質體Lipofectamine2000以及PEI25K的轉染效率之間的差異。MTT細胞毒性實驗檢測該納米載體介導的阿霉素和Livin基因的下調對骨肉瘤細胞增殖的聯(lián)合抑制作用。
　　結果：
　　第一部分：Livin及PlGF表達主要定位于骨肉瘤細胞的細胞質，少數(shù)位于細胞核，為棕黃色顆粒。57

11、例骨肉瘤組織中Livin及PlGF陽性表達數(shù)為分別為30例(52.6％)和37例(64.9％)，該兩種蛋白在10例正常骨組織中均無陽性表達。兩者在骨肉瘤組織中的表達顯著高于正常骨組織(P<0.05)。Livin與PlGF mRNA在三種骨肉瘤(MG-63、Saos-2、U2-OS)細胞中均呈現(xiàn)表達。Real-time PCR結果顯示Livin基因在MG-63細胞中的表達明顯高于在Saos-2和U2-OS細胞中的表達，分別是后者的1.59

12、和2.39倍。PlGF mRNA在MG-63細胞中的表達分別是U2-OS細胞的8.57倍和Saos-2細胞的3.49倍。Livin及PlGF的陽性表達在不同年齡、性別、腫瘤部位及病理學分型分組之間的差異無統(tǒng)計學意義。而在不同骨肉瘤Enneking臨床分期、腫瘤大小分組之間的差異具有統(tǒng)計學意義。在腫瘤直徑≤5cm的38例標本中，Livin的陽性表達率為42.1％，>5cm的19例標本中為73.7％，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0

13、02)。而PlGF在腫瘤≤5cm與>5cm的兩組之間的陽性表達率分別為52.6％和89.5％，差異具有統(tǒng)計學意義(P=-0.013)。PlGF在Ⅰ B～ⅡA期骨肉瘤中的陽性表達率僅為40.0％，ⅡB～Ⅲ期為78.4％，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.008)。Ⅰ B～ⅡA期骨肉瘤中，Livin的陽性表達率為30％，但在ⅡB～Ⅲ期中為64.9％，兩組之間的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。30例Livin蛋白表達陽性的骨肉瘤組

14、織，PlGF蛋白表達陽性者為22例，在Livin陰性表達的26例標本中PlGF有6例陰性表達。在骨肉瘤中，Livin的陽性表達與PlGF的陽性表達之間不具有相關性(P=-0.642)。
　　第二部分：紫外光譜及紅外光譜表征結果表明氧化葡聚糖分子中出現(xiàn)了葡聚糖分子本身不具有的醛基結構。鹽酸羥胺滴定實驗表明氧化葡聚糖的醛基含量與投入反應的高碘酸鈉的質量成正比，水相凝膠滲透色譜分析結果表明隨著氧化程度的增加，氧化葡聚糖的分子量相應減少。

15、當投入反應的高碘酸鈉與葡聚糖質量比為2時，所形成的氧化葡聚糖的醛基含量是15.8 mmol/L，而此時其分子量由40000減少到13000左右。葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體分別在490 nm處出現(xiàn)阿霉素的特征性紫外吸收峰以及在核磁共振圖譜的3.9-4.0 ppm和2.5-3.2 ppm處分別出現(xiàn)了阿霉素和聚乙烯亞胺的特征峰。激光粒度儀測定該納米載體的粒徑和Zeta電位分別為225±47 nm和+33.84±4.1 mV。上述表征結

16、果均表明阿霉素和聚乙烯亞胺已被成功偶合到氧化葡聚糖分子上。紫外分光光度法測定該納米載體中阿霉素的偶合率為17.43±0.548％，并且在雙蒸水溶液中較穩(wěn)定，以雙蒸水為介質透析4天后游離阿霉素的濃度由0.0107±0.005 mg/L減少至0.0023±0.005 mg/L。透射電鏡結果顯示該納米粒為近似圓形，分散性較好。納米載體與DNA以不同的N/P比混合后所形成復合物的粒徑隨N/P比的增加呈現(xiàn)減小的趨勢，Zeta電位卻呈現(xiàn)相反的趨勢。

17、當N/P為4時，納米基因復合物的粒徑減少到166±22 nm，Zeta電位則為+14.47±4.1 mV。而N/P進一步增大到20，納米基因復合物的粒徑也隨之減小到146±23 nm，此時的Zeta電位則增加到為+24.71±5.3 mV。MTT細胞毒性實驗表明給藥24小時后，阿霉素對MG-63和Saos-2細胞的增殖抑制作用均低于同濃度的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體，但兩組之間的差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而給藥48小

18、時后納米載體的細胞抑制作用則明顯高于游離阿霉素(P<0.05)。而單純葡聚糖-聚乙烯亞胺共聚物在不同時間點對兩種骨肉瘤細胞的增殖抑制作用明顯低于游離阿霉素和葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　第三部分：測序結果表明，所獲得的重組干擾質粒目的片段與預期完全相符，表明退火形成的干擾寡核苷酸成功連接入pGenesil-1載體。干擾質粒轉染的MG-63細胞在倒置熒光顯微鏡下呈明亮綠色熒光，表明細胞

19、中有轉染的外源基因表達。Real-time PCR結果表明Livin shRNh質粒有抑制MG-63細胞中Livin基因表達的作用，干擾作用達72％；轉染Livin shRNA質粒后的細胞中Livin基因表達水平明顯低于空白對照組、非特異性轉染組，(P<0.05)。而空白對照組、非特異性轉染組相比，Livin基因表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。轉染后Livin蛋白顯色可見，特異性Livin shRNA質粒轉染組的Livin蛋白

20、染色條帶減弱，Livin shRNA有抑制Livin蛋白表達的作用，干擾作用達69％。特異性轉染Livin shRNh組的Livin蛋白表達水平明顯低于空白對照組、非特異性轉染組(P<0.05)。而空白對照組、非特異性轉染組相比，Livin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Westem blot結果與Real-time PCR結果一致。倒置熒光顯微鏡以及流式細胞術均表明葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體能有效地將Livin

21、shRNA表達質粒轉入骨肉瘤細胞中，其在MG-63和Saos-2細胞中的轉染效率分別是18.6±0.40％和15.3±0.50％。轉染效率與PEI25K相似但稍低于Lipofectamine2000的轉染效率。MTT細胞毒性實驗結果表明在轉染早期，納米載體介導的Livin shRNA質粒轉染邯可霉素對骨肉瘤細胞的增殖抑制作用與游離阿霉素組及納米基因載體組相似，但給藥72小時后納米載體介導Livin shRNh質粒轉染邯可霉素組的骨肉瘤細

22、胞存活率明顯低于游離阿霉素組和納米基因載體組(P<0.05)。其中納米基因載體組對骨肉瘤細胞的增殖抑制作用又明顯高于游離阿霉素組(P<0.05)。
　　結論：
　　第一部分：本研究首次應用免疫組織化學方法檢測PlGF在骨肉瘤組織和正常骨組織中的表達，同時應用Real-time PCR方法分別檢測Livin和PlGF在三種不同骨肉瘤細胞株中的表達，分析Livin和PlGF的陽性表達與骨肉瘤患者的臨床特征以及不同骨肉瘤細胞株的分

23、化成熟程度之間的相關性，同時研究骨肉瘤組織中PlGF與Livin陽性表達之間的相關性。實驗結果表明Livin和PlGF均在骨肉瘤組織以及三種骨肉瘤細胞株(MG-63、Saos-2以及U2-OS)中呈現(xiàn)高表達，Livin和PlGF在不同骨肉瘤細胞株中的表達差異可能與細胞的分化成熟程度相關。Livin和PlGF蛋白在骨肉瘤組織中的陽性表達之間不具有相關性。Livin及PlGF陽性表達與骨肉瘤患者年齡、性別、發(fā)病部位以及病理分型之間均不具有相

24、關性，與骨肉瘤的腫瘤大小、腫瘤Enneking臨床分期具有明顯相關性，有可能與骨肉瘤的發(fā)生及發(fā)展相關。但兩者是否可單獨或同時作為骨肉瘤患者預后的判斷指標需要進一步驗證。隨著研究的不斷深入，Livin及PlGF可望成為骨肉瘤的基因治療、免疫治療的新靶點。
　　第二部分：本研究中應用高碘酸鈉引發(fā)的氧化反應，葡聚糖T40被氧化產生醛基，氧化葡聚糖可通過其分子中的醛基與阿霉素及聚乙烯亞胺分子中的游離氨基反應，以雪夫氏堿的形式將三者偶合成穩(wěn)

25、定的納米基因載體。該偶合阿霉素的納米載體能有效地縮合DNA從而以靜電吸附的方式形成葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因復合物，該納米基因復合物由于具有較小的粒徑和陽性表面電荷，可通過其EPR效應選擇性靶向腫瘤組織。通過其表面正電荷與腫瘤細胞結合而被細胞內吞，有效地將其攜帶的阿霉素以及目的基因材料同時轉入骨肉瘤細胞中。
　　第三部分：本研究構建了Livin shRNA真核表達載體并經基因測序驗證了其準確性，該表達載體被轉染入骨肉瘤MG

26、-63細胞后可有效地下調細胞中Livin的mRNA和蛋白的表達。Livin shRNA質粒穩(wěn)定轉染的MG-63細胞的建立為今后進一步繼續(xù)研究Livin在骨肉瘤細胞中的作用奠定了實驗基礎。葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體能將有效地阿霉素和Livin shRNA質粒同時轉入骨肉瘤細胞(MG-63和Saos-2)中。由于葡聚糖酶對納米載體中葡聚糖的降解作用，偶合在該納米載體上的阿霉素被釋放并發(fā)揮對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用。與此同時，轉染的L

27、ivin shRNA質粒通過RNA干擾的方式下調凋亡抑制蛋白Livin的表達，促使骨肉瘤細胞對阿霉素的敏感性增加，從而進一步誘導骨肉瘤細胞的凋亡。該納米載體合成所用的葡聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，氧化后依然保存著其良好的特性。隨著納米載體在體內的降解，低分子量PEI釋放后可被排泄，其細胞毒性明顯小于無排泄途徑的高分子量PEI。低分子量PEI與氧化葡聚糖交聯(lián)后其轉染效率大大提高，與PEI25K的轉染效率相近。由于腫瘤血管通透性