納米基因載體介導(dǎo)RNA干擾沉默Survivin基因治療大腸癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：制備轉(zhuǎn)染率高、安全無(wú)毒的新型殼聚糖-聚乙二醇納米基因載體，研究其介導(dǎo)的靶向人survivin的RNAi基因納米復(fù)合物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中survivin mRNA的表達(dá)，及其對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡和增殖的影響和意義。
　　 方法：通過(guò)兩步接枝共聚法，優(yōu)化制備工藝，制備粒徑較小、粒度分布均勻的殼聚糖-聚乙二醇納米顆粒。使用Malvem Zetasizer3000E對(duì)納米粒的粒徑及zeta電位進(jìn)行檢測(cè)；利用原子力顯微鏡對(duì)納米

2、顆粒的形態(tài)進(jìn)行觀察。
　　 選取人survivin基因(NM_001168)序列中的相關(guān)位點(diǎn)序列構(gòu)建靶向survivin的shRNA重組質(zhì)粒，通過(guò)序列測(cè)定檢測(cè)重組子的正確性，再?gòu)闹泻Y選出最佳的survivin shRNA重組質(zhì)粒載體。合成殼聚糖-聚乙二醇納米粒介導(dǎo)的survivin RNAi基因納米復(fù)合物，將其導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中（以攜帶相同shRNA的脂質(zhì)體載體，survivinshRNA以及陰性對(duì)照shRNA為對(duì)照）。

3、用RT-PCR和Western-blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的HT-29細(xì)胞中Survivin mRNA和蛋白表達(dá)量的變化；通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；
　　 結(jié)果：Malvem Zetasizer3000E激光粒度分析儀進(jìn)行粒徑及分布的檢測(cè)結(jié)果顯示，制備出的殼聚糖-聚乙二醇納米顆粒的平均粒徑值為61nm。粒徑大小分布呈正態(tài)分布，分布均勻。原子力顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。納米顆粒呈圓球形，表面平滑完整，分散良好，較少粘附團(tuán)聚現(xiàn)象；且細(xì)胞毒性低

4、、轉(zhuǎn)染率高。序列測(cè)定重組質(zhì)粒載體survivin-shRNA構(gòu)建正確。轉(zhuǎn)染殼聚糖-聚乙二醇介導(dǎo)的survivin shRNA基因納米復(fù)合物后發(fā)現(xiàn)，該基因納米復(fù)合物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的轉(zhuǎn)染效率顯著高于survivin shRNA和脂質(zhì)體載體(P＜0.01)；HT-29細(xì)胞中SurvivinmRNA拷貝數(shù)及蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，且結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的細(xì)胞死亡率和凋亡率明顯提高(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：本研究成

5、功制備出平均粒徑為61nm，分布均勻的殼聚糖-聚乙二醇納米顆粒；其細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染率高。合成的殼聚糖-聚乙二醇介導(dǎo)survivin shRNA基因納米復(fù)合物能夠高效轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29并有效干擾Survivin，且較之?dāng)y帶相同shRNA的脂質(zhì)體載體，survivin shRNA和陰性對(duì)照shRNA具有更高的干擾效率，能高效地誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。其介導(dǎo)RNA干擾能長(zhǎng)時(shí)間高效率地沉默結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中的Survivin