轉(zhuǎn)染人內(nèi)皮抑素基因治療人大腸癌裸鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文轉(zhuǎn)染人內(nèi)皮抑素基因治療人大腸癌裸鼠的實(shí)驗(yàn)研究姓名：張波申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：吳肇漢2001.5.1中丈摘要結(jié)果：pcDNA3一hEN質(zhì)粒酶切鑒定的電泳結(jié)果顯示：pcDNA3hEN質(zhì)粒確買(mǎi)有一個(gè)560bp左右的插入片段，大小和hENcDNA大致相符。測(cè)序結(jié)果也顯示與hEN基因的堿基序列完全一致，加上的信號(hào)肽基因序列與人單細(xì)胞化學(xué)趨向蛋白I的序列相同。另外，該基因的兩端有HindlII和ClaI的酶切位

2、點(diǎn)，并有起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示：SA脂質(zhì)體介導(dǎo)的pcDNA3一hEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞24小時(shí)后，LoVo細(xì)胞中檢測(cè)到hENmRNA表達(dá)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)構(gòu)建質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和mRAN表達(dá)水平上進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，pcDNA3hEN質(zhì)粒的構(gòu)建完全正確。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)PCR方法將人單細(xì)胞化學(xué)趨向蛋白I的信號(hào)肽基因序列加到hENcDNA，以使轉(zhuǎn)錄成mRNA后的翻譯產(chǎn)物具備跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能。第二部分人

3、內(nèi)皮抑素基因在人大腸癌裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染研究研究目的：本研究是在建立人大腸癌裸鼠模型基礎(chǔ)上，再轉(zhuǎn)染hEN基因，觀(guān)察hEN基因在腫瘤組織的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效果。本研究擬解決的主要問(wèn)題：(1)建立合適的人大腸癌裸鼠模型；(2)瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染hEN基因(3)基因轉(zhuǎn)染后，檢測(cè)hEN基因mRNA在人大腸癌裸鼠組織中的表達(dá)。材料和方法：將種植了人大腸癌的荷瘤裸鼠隨機(jī)分成4組：SA脂質(zhì)體／pcDNA3hEN組(SApcDNA3hEN)、SA脂質(zhì)體／pcDNA3組(S

4、ApcDNA3)、SA脂質(zhì)體(SA)組和生理鹽水(NS)組。裸鼠皮下均勻注射LoVo細(xì)胞懸液100uL，含1106個(gè)LoVo細(xì)胞制作人大腸癌裸鼠動(dòng)物模型。待腫瘤長(zhǎng)到23ram時(shí)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。pcDNA3一hEN的劑量為40“g，SA脂質(zhì)體與pcDNA3，hEN按2：1的質(zhì)量比混勻，在室溫下靜置30分鐘配置而成。采用的轉(zhuǎn)染方式為腫瘤內(nèi)注射。第16天時(shí)處死小鼠，取下腫瘤標(biāo)本，采用RTPCR檢測(cè)hEN—mRNA的表達(dá)。結(jié)果：裸鼠皮下注射LoV