沉默Scinderin基因在骨肉瘤Saos2細(xì)胞中的相關(guān)功能研究.pdf

1、第一部分:沉默Scinderin基因在骨肉瘤Saos2細(xì)胞中的相關(guān)功能研究
　　目的
　　1)構(gòu)建肌切蛋白(Scinderin，SCIN)基因 siRNA慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染骨肉瘤Saos2細(xì)胞。
　　2)通過沉默SCIN基因在骨肉瘤Saos2細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其對(duì)骨肉瘤Saos2細(xì)胞相關(guān)功能的影響。
　　方法
　　1)構(gòu)建SCIN-siRNA慢病毒載體并轉(zhuǎn)染骨肉瘤Saos2細(xì)胞；
　　2)采用Real

2、 time-PCR及Western blot兩種方法檢測轉(zhuǎn)染后的Saos2細(xì)胞，分別在mRNA水平和蛋白水平檢測SCIN的沉默效率；
　　3)細(xì)胞增殖情況觀察：CCK-8法分別檢測siRNA-SCIN慢病毒載體的Saos2細(xì)胞（KD）、空白對(duì)照(NC)，以及轉(zhuǎn)染含無義序列的慢病毒載體為陰性對(duì)照(CON)三組細(xì)胞增殖能力；
　　4)細(xì)胞侵襲能力觀察：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及 Transwell實(shí)驗(yàn)分別觀察感染siRNA-SCIN慢病毒載

3、體的Saos2細(xì)胞（KD）、空白對(duì)照(NC)，以及轉(zhuǎn)染含無義序列的慢病毒載體為陰性對(duì)照(CON)三組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力變化。
　　結(jié)果
　　1)經(jīng)鑒定確認(rèn)慢病毒載體構(gòu)建成功后，分別轉(zhuǎn)染入骨肉瘤 Saos2細(xì)胞，質(zhì)粒攜帶有GFP綠色熒光蛋白基因，熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞可見綠色熒光，鏡下觀察KD組及CON組，分別達(dá)到90%和85%以上帶有綠色熒光，證明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。
　　2)通過Real-time PCR和West

4、ern-blot兩種實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證沉默SCIN基因效率。結(jié)果顯示，siRNA-SCIN（KD）組細(xì)胞中 SCIN基因在 mRNA水平和蛋白水平均較CON及NC組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而CON與NC兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3) CCK-8生長曲線觀察發(fā)現(xiàn)沉默SCIN基因，Saos2細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組明顯提高,與對(duì)照組自第2日起出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　4)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)提

5、示siRNA-SCIN(KD)組在24h，48h向劃痕中生長的距離和數(shù)量均較CON組及NC組細(xì)胞多，侵襲能力明顯提高，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0．05及P<0．01)。
　　5) Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA-SCIN(KD)組較CON及NC組的侵襲率顯著提高（P<0．05)。而CON與NC兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論
　　1)本組實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建 siRN-SCIN慢病毒載體，并

6、成功轉(zhuǎn)染骨肉瘤 Saos2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的Saos2細(xì)胞SCIN基因的表達(dá)明顯抑制。
　　2) SCIN基因的沉默使骨肉瘤Saos2細(xì)胞的增值率及轉(zhuǎn)移、侵襲率明顯提高，提示在高發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者腫瘤細(xì)胞中可能存在 SCIN基因的表達(dá)減少或缺乏。故SCIN基因過表達(dá)是否能成為預(yù)防骨肉瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的一種治療手段值得進(jìn)一步研究。
　　第二部分:166例兒童及青少年骨肉瘤患者臨床特點(diǎn)比較及預(yù)后影響因素分析
　　目的
　

7、　比較兒童骨肉瘤與青年骨肉瘤臨床特點(diǎn)差異，探討影響預(yù)后的相關(guān)因素。
　　方法
　　1)回顧2003年10月至2012年3月間收治并確診為骨肉瘤的166例19歲以下兒童及青年患者的病例資料，并對(duì)其預(yù)后進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間3～103個(gè)月，平均53.0個(gè)月，根據(jù)年齡將其分為兒童骨肉瘤(≤14歲)及青年骨肉瘤(14～19歲)兩組，比較兩組患者之間臨床特點(diǎn)的差異;應(yīng)用Kaplan—Meier法計(jì)算患者生存率。
　　2)以性別、年齡

8、、KPS評(píng)分、腫瘤生長部位、腫瘤體積大小、Enneking外科分期、病理性骨折、手術(shù)方式、新輔助化療、術(shù)后輔助化療次數(shù)、局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移12項(xiàng)因素為變量指標(biāo)，應(yīng)用Log—rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，應(yīng)用 Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，研究這些因素與骨肉瘤患者生存率之間的關(guān)系。
　　3)以卡方檢驗(yàn)比較新輔助化療與手術(shù)方式、新輔助化療與肺內(nèi)轉(zhuǎn)移、新輔助化療與局部復(fù)發(fā)、手術(shù)方式與局部復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。同時(shí)觀察積極治療肺轉(zhuǎn)移對(duì)預(yù)后的影響。

9、
　　結(jié)果
　　1)166例骨肉瘤患者中位生存時(shí)間為31.0個(gè)月（95%可信區(qū)間22.0-40.0個(gè)月），累計(jì)1年，2年和3年生存率分別為90±2%、59±4%和45±4%。
　　2)兒童骨肉瘤與青年骨肉瘤相比，前者更多接受截肢手術(shù)治療（P=0.010）。兩組在性別、Enneking外科分期、KPS評(píng)分、病理性骨折、腫瘤壞死率、病理分型、腫瘤部位、輔助化療次數(shù)及腫瘤體積大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3)單因素統(tǒng)計(jì)分

10、析顯示骨肉瘤有效預(yù)后因素有6個(gè)，分別為 KPS評(píng)分、Enneking外科分期、是否接受新輔助化療、術(shù)后輔助化療次數(shù)（≥6次與<6次）、術(shù)后有無復(fù)發(fā)、是否伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
　　4)多因素統(tǒng)計(jì)分析顯示KPS評(píng)分、術(shù)后輔助化療次數(shù)及是否伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　5)卡方檢驗(yàn)顯示新輔助化療與保肢率相關(guān)，而與肺轉(zhuǎn)移，局部復(fù)發(fā)無關(guān)。手術(shù)方式與局部復(fù)發(fā)之間無相關(guān)性；然而積極處理肺部轉(zhuǎn)移灶對(duì)生存有明顯影響（P=0.000）。