慢性乙型病毒性肝炎病人CCR5基因表達(dá)的多態(tài)性研究.pdf

1、目的： 慢性乙型病毒性肝炎是一種嚴(yán)重危害我國人民健康的疾病。局部的調(diào)查顯示，國內(nèi)一般人群HBsAg陽性率約為9％。這些乙肝病毒攜帶者中的大部分機(jī)體最終將病毒清除，但是仍有相當(dāng)一部分?jǐn)y帶者轉(zhuǎn)變成為慢性乙型肝炎。同一種病毒感染不同的宿主，產(chǎn)生不同的后果，說明慢性乙型病毒性肝炎的發(fā)生，除了病毒感染以外，還與宿主的遺傳易感性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬觀察慢性乙肝病人和健康體檢者中CCR5基因表達(dá)的多態(tài)性情況，以探討CCR5表達(dá)和慢性乙型病毒性肝炎的

2、關(guān)系。 方法： 實(shí)驗(yàn)一：實(shí)驗(yàn)組病例選自本院肝病?？撇》渴罩蔚穆砸倚筒《拘愿窝撞∪?，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2000年9月(西安)第十次全國傳染病和寄生蟲病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的病毒性肝炎防治方案中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除以下病人：①病人重疊有丙型，丁型肝炎的；②病人合并有肝臟惡性腫瘤的。對(duì)照組選白同期在我院進(jìn)行健康體檢的普通人群，并排除體檢結(jié)果中有①HBsAg陽性，②肝功能ALT或者GGT大于正常值上限③HBVDNA定量大于500copies/

3、ml的個(gè)體。實(shí)驗(yàn)組病人入院后抽靜脈血，測(cè)定GGT，ALT，測(cè)定乙肝五項(xiàng)，對(duì)照組體檢者測(cè)定GGT，ALT和乙肝五項(xiàng)。同時(shí)留EDTA抗凝血標(biāo)本2ml，先用簡化鹽析法提取DNA備用。對(duì)于符合入選標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化。酶切產(chǎn)物經(jīng)2.0％瓊脂凝膠電泳，最后用紫外線凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)二：病例選自本院肝病?？撇》渴罩蔚穆砸倚筒《拘愿窝撞∪?，診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)驗(yàn)一，病人入院后抽靜脈

4、血，測(cè)定HBVDNA定量，測(cè)定GGT，ALT，測(cè)定乙肝五項(xiàng)，同時(shí)留EDTA抗凝血標(biāo)本2ml，先用簡化鹽析法提取DNA備用。對(duì)于符合入選標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)驗(yàn)一。 結(jié)果： 用特異性引物擴(kuò)增的DNA片段起始于CCR5基因的97位，終止于+53位，片段長1010bp，BglⅡ識(shí)別序列A^GATCT，當(dāng)503位的堿基是G時(shí)(即503位沒有發(fā)生突變)在所擴(kuò)片段中僅有503位符合該識(shí)別序列的酶切位點(diǎn)，所以該產(chǎn)物片段被切成兩個(gè)

5、部分；當(dāng)503位的堿基是T時(shí)(即503位發(fā)生了點(diǎn)突變)在所擴(kuò)片段中沒有符合該識(shí)別序列的酶切位點(diǎn)，該產(chǎn)物片段不能被該酶消化。BstMCI識(shí)別序列CGAT^CG，當(dāng)999位點(diǎn)堿基是G時(shí)(即999位沒有發(fā)生突變)在所擴(kuò)片段中沒有符合該識(shí)別序列的酶切位點(diǎn)，該產(chǎn)物片段不能被該酶消化；當(dāng)999位的堿基是T時(shí)(即999位發(fā)生了點(diǎn)突變)，1000位符合該識(shí)別序列中的酶切位點(diǎn)，從而使該片段可以被該酶消化，產(chǎn)物被分為兩個(gè)片段。 CCR5基因的503

6、位點(diǎn)，在慢性乙型病毒性肝炎的病人中，表達(dá)G的個(gè)體較多，而在對(duì)照的健康體檢人群中，表達(dá)T的個(gè)體較多，二者相比有顯著性差異(P＜0.005)。 同樣的，CCR5基因的999位點(diǎn)，在慢性乙型病毒性肝炎的病人中，表達(dá)G的個(gè)體較多，而在對(duì)照的健康體檢人群中，表達(dá)T的個(gè)體較多，二者相比有顯著性差異(P＜0.05)。 在慢性乙型病毒性肝炎病人中，CCR5基因的503、999位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生變異，或者503、999位點(diǎn)的其中一個(gè)發(fā)生變異的病

7、人和兩個(gè)位點(diǎn)均不發(fā)生變異的個(gè)體之間比較，兩組病人之間的HBVDNA水平有顯著性差異(P＜0.05)，而CCR5基因的503、999位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生變異，503和999位點(diǎn)其中一個(gè)發(fā)生變異的三組個(gè)體比較，HBVDNA水平無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 當(dāng)CCR5基因503位表達(dá)T時(shí)，和/或999位表達(dá)T時(shí)，其產(chǎn)物可能有保護(hù)機(jī)體免受乙型肝炎病毒侵害的作用或者有促進(jìn)機(jī)體清除乙型病毒性肝炎病毒的作用，但尚不能證明二者同時(shí)變異時(shí)