PD-1-B7H1通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能和表型及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:膿毒癥是病情進(jìn)展迅速的危重疾病，是戰(zhàn)創(chuàng)傷、休克及手術(shù)后常見的并發(fā)癥。膿毒癥及其引起的多器官功能障礙是ICU患者死亡的重要因素，目前臨床上尚無特異性治療手段。巨噬細(xì)胞是天然免疫的重要組成部分，在炎癥啟動和病原清除中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞功能障礙伴隨著膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。在感染的初始階段，巨噬細(xì)胞在各種外來物質(zhì)的刺激下過度活化，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，進(jìn)而招募激活中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致系統(tǒng)性全身炎癥反應(yīng)綜合征。此外，巨噬細(xì)胞通過

2、分泌細(xì)胞因子，攝取遞呈抗原，從而激活淋巴細(xì)胞功能，協(xié)同啟動獲得性免疫反應(yīng)。在膿毒癥中，巨噬細(xì)胞過度活化后，會進(jìn)入功能抑制狀態(tài)，表現(xiàn)為吞噬功能低下，分泌細(xì)胞因子能力降低。近年來研究發(fā)現(xiàn)，共抑制分子程序性死亡受體-1(PD-1)/程序性死亡受體配體-1(PD-L1或B7H1)信號通路與膿毒癥免疫耐受密切相關(guān)。通過PD-1或B7H1基因缺陷的小鼠發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-1∶ B7H1信號通路可以減輕膿毒癥引起的臟器損傷，降低血漿炎癥因子，增強(qiáng)細(xì)菌清除

3、能力，從而改善小鼠的生存期。值得注意的是，在膿毒癥中，PD-1和B7H1基因缺陷的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能較野生型小鼠有明顯改善，表現(xiàn)為感染局部的數(shù)量增多，產(chǎn)生的細(xì)胞因子增多;PD-1敲除小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能明顯高于野生型膿毒癥小鼠。在膿毒癥患者的研究中發(fā)現(xiàn)，通過抗PD-L1抗體體外阻斷PD-1∶ B7H1通路，可以改善患者外周血單核細(xì)胞的功能，促進(jìn)其分泌更多的炎癥因子。綜上所述，PD-1∶ B7H1通路在膿毒癥時巨噬細(xì)胞功能障礙中可

4、能發(fā)揮重要的作用，且PD-1基因缺陷或B7H1基因缺陷后對巨噬細(xì)胞功能的影響可能有不同之處。PD-1∶B7H1在巨噬細(xì)胞上表達(dá)受何調(diào)控，對巨噬細(xì)胞的功能和表型有何調(diào)節(jié)作用目前尚不明確。
　　本課題擬首先利用PD-1基因缺陷和B7H1基因缺陷小鼠，分別通過培養(yǎng)骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)和腹腔巨噬細(xì)胞(PM)，研究巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，抗原遞呈相關(guān)分子的表達(dá)，細(xì)胞極化以及吞噬功能的影響及其機(jī)制。最后利用PD-1和PD-L1基因敲除小

5、鼠，在體觀察基因缺陷后對巨噬細(xì)胞活化和表型的影響，并進(jìn)一步研究其在膿毒癥模型中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。
　　實驗對象及方法:
　　1、周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠，PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各8只，處死后收集股骨和脛骨骨髓腔細(xì)胞，給予集落刺激因子(M-CSF)刺激，體外培養(yǎng)7d后獲得骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)。周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠，PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各8只，給予腹腔注射1m13

6、％巰基乙酸鹽，4天后灌洗腹腔，收集腹腔巨噬細(xì)胞(PM)。標(biāo)記F4/80抗體后，流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞純度。
　　2、對培養(yǎng)成熟的BMDM及腹腔來源的PM，給予不同濃度的LPS刺激24h后，收集上清，ELISA檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表達(dá)水平;周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠，PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各6只，給予腹腔注射5mg/kgLPS，8h后處死小鼠，收集外周血及腹腔灌洗液

7、，ELISA檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表達(dá)水平。
　　3、對培養(yǎng)成熟的BMDM及PM計數(shù)鋪板后，給予LPS或IFN-γ刺激24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ分子的表達(dá);將培養(yǎng)成熟的BMDM分為對照組和IFN-γ刺激組，western-blotting檢測細(xì)胞STAT-1和STAT-3的磷酸化水平。
　　4、周齡匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠，PD-1-/-

8、和B7H1-/-小鼠各12只，隨機(jī)均分為對照組和CLP組，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測腹腔巨噬細(xì)胞和脾臟巨噬細(xì)胞(SM)表面CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ分子的表達(dá);收集各組naive小鼠外周血，ELISA檢測血漿中IFN-γ和IL-12p70的水平;收集各組naive小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，western-blotting檢測STAT-4的磷酸化水平。
　　5、對培養(yǎng)成熟的BMDM計數(shù)鋪板后，給予IFN-γ或IL-4刺激24h后，分

9、別收集總RNA和細(xì)胞蛋白，使用實時定量熒光PCR和western-blotting檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子i-NOS、精氨酸酶、CD206和YM-1的mRNA和蛋白表達(dá)
　　6、對培養(yǎng)成熟的BMDM或PM計數(shù)鋪板后，分為對照組和LPS刺激組，加入熒光標(biāo)記的大腸埃希桿菌1h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞的吞噬能力。
　　結(jié)果:
　　1、利用野生型小鼠，PD-1-/-和B7H1-/-小鼠培養(yǎng)獲得的BMDM和PM，生長狀態(tài)良好，

10、純度達(dá)到80-95％。
　　2、給予低濃度LPS(1ng/ml)刺激時，從PD-1-/-和B7H1-/-小鼠來源的BMDM和PM分泌的細(xì)胞因子高于野生型小鼠;當(dāng)給予高濃度LPS(100ng/ml)刺激時，基因缺陷小鼠來源的巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與野生型小鼠組沒有明顯差異。給予非致死劑量的LPS刺激后，PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血漿中細(xì)胞因子的表達(dá)水平高于野生型小鼠;基因缺陷小鼠的腹腔灌洗液中IL-6和IL-12p70表達(dá)水

11、平高于野生型小鼠，TNF-α和IL-10的表達(dá)水平過低，檢測不出。
　　3、B7H1-/-組BMDM表面CD80和MHC-Ⅱ表達(dá)水平低于野生型對照組，在LPS或IFN-γ刺激后，CD80表達(dá)水平仍然顯著低于野生型對照組;B7H1-/-組PM表面MHC-Ⅱ表達(dá)水平顯著高于野生型對照組。PD-1-/-組PM表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ表達(dá)水平顯著高于野生型對照組。PD-1-/-和B7H1-/-組巨噬細(xì)胞在IFN-γ刺激前后的ST

12、AT-1和STAT-3磷酸化水平與野生型組均無顯著差異。
　　4、PD-1-/-和B7H1-/-組naive小鼠PM表達(dá)更高水平的MHC-Ⅱ分子，PD-1-/-組PM和SM表面CD80表達(dá)水平高于野生型小鼠。PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血漿中IL-12p70表達(dá)水平高于野生型小鼠組，但I(xiàn)FN-γ的表達(dá)水平與野生型小鼠無明顯差異;PD-1-/-和B7H1-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的STAT-4磷酸化水平顯著高于野生型小鼠。與對照組

13、相比，膿毒癥小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面CD86、CD40和MHC-Ⅱ的表達(dá)顯著降低;脾臟巨噬細(xì)胞表面CD80的表達(dá)水平明顯升高;與野生型小鼠相比，PD-1-/-和B7H1-/-組膿毒癥小鼠表達(dá)相當(dāng)水平的抗原遞呈相關(guān)分子。
　　5、與野生型小鼠組相比，PD-1/-和B7H1-/-組BMDM在IFN-γ刺激后表達(dá)的i-NOS和TNF-α mRNA及蛋白水平?jīng)]有顯著差異;在IL-4刺激后，各組之間精氨酸酶和YM-1的mRNA和蛋白表達(dá)均無差異

14、，但B7H1-/-組表達(dá)更高水平的CD206蛋白。
　　6、LPS預(yù)處理6h后，巨噬細(xì)胞的吞噬功能并無明顯變化;與野生型小鼠比，PD-1-/-和B7H1-/-組BMDM或PM在LPS刺激前后的吞噬功能均無顯著差異。
　　結(jié)論:PD-1∶B7H1通路參與負(fù)性調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在LPS刺激下細(xì)胞因子的分泌。PD-1或B7H1基因缺陷可以不同方式影響巨噬細(xì)胞的表面抗原遞呈相關(guān)分子的表達(dá)，其調(diào)節(jié)作用與巨噬細(xì)胞的來源和不同的刺激方式相關(guān)。P