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文檔簡介
1、第一部分膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有放療抵抗特性
目的:比較放療后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與其對應(yīng)分化細(xì)胞的細(xì)胞周期,細(xì)胞存活與凋亡方法:(1)將人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞,U251細(xì)胞用不含血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)成具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞U87-sph,U251-sph。將人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞系NCH-421k用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1周誘導(dǎo)分化為NCH-421k-dif。(2)用流式,RT-PCR和免疫熒光鑒定干細(xì)胞和分化細(xì)胞特征性分子標(biāo)記物的表達。(3
2、)對U87和U87-sph進行X射線照射,檢測兩種細(xì)胞在不同放射劑量,照射后不同時間點的凋亡率,細(xì)胞周期和細(xì)胞存活率。U251和U251-sph在X線照射后的凋亡率也同樣進行了測定。用Hoechst33342/PI染色檢測放療后U87和U87-sph凋亡壞死情況。
結(jié)果:(1)U87和U251經(jīng)過干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后,表現(xiàn)為成球懸浮生長,NCH-421k用分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后呈貼壁生長,細(xì)胞形態(tài)為梭形。(2)用流式,RT-PCR
3、檢測發(fā)現(xiàn)U87-sph和U251-sph的干細(xì)胞標(biāo)記物(CD133,nestin,Sox-2)較U87和U251明顯上升。NCH-421k-dif的干細(xì)胞標(biāo)記物較誘導(dǎo)分化前明顯降低,而分化標(biāo)記物GFAP明顯升高。細(xì)胞免疫熒光檢測U87-sph的干細(xì)胞標(biāo)記物表達增強。(3)U87-sph不同劑量X射線照射后不同時間點的細(xì)胞存活率均較U87高。U87在X射線照射后存在明顯的G2/M期阻滯,以12h和24h最為顯著;U87-sph在X射線照射
4、后細(xì)胞周期變化不明顯。U87-sph和U251-sph在X射線照射后的細(xì)胞凋亡率明顯較其親本細(xì)胞U87和U251降低。Hoechst33342/PI染色顯示放療后U87凋亡壞死增加,U87-sph未見明顯的凋亡壞死。
結(jié)論:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系用無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)可培養(yǎng)出具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1周可誘導(dǎo)分化。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞較其分化細(xì)胞具有放療抵抗的特性。
第二部分放療抵抗膠質(zhì)瘤干細(xì)胞
5、株的篩選鑒定和特性研究及TRADD,DR5在放療抵抗膠質(zhì)瘤干細(xì)胞株中的表達
目的:構(gòu)建放療抵抗的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞株(GSC-R)并初步探討其放療抵抗的機制。
方法:對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞系 NCH-421k,NCH-644和本實驗室前期建立的 U87-sph進行長期劑量遞增的 X線照射,篩選出存活下來的放療抵抗的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞株NCH-421k-R,NCH-644-R和U87-sph-R。對篩選出的細(xì)胞株進行放射生物學(xué)的鑒定,繪制
6、生長曲線,存活曲線并計算出放射生物學(xué)參數(shù)D0,Dq和SF2等。對三種GSC-R及其親本細(xì)胞系的放療后細(xì)胞周期和凋亡率進行了分析。對放療抵抗膠質(zhì)瘤干細(xì)胞株的干細(xì)胞標(biāo)記物CD133進行了流式測定。對其干細(xì)胞標(biāo)記物和侵襲相關(guān)基因 MMP-2,MMP-9進行了 RT-PCR的檢測。對本課題研究的死亡受體分子TRADD,DR5和其他凋亡相關(guān)蛋白進行了RT-PCR和western blot檢測。
結(jié)果:NCH-421k-R,NCH-644
7、-R和U87-sph-R的D0,Dq和SF2均顯著增加。放療抵抗的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞株放療后 G2/M期阻滯明顯減少,放療后凋亡率降低。NCH-644-R和U87-sph-R與其親本膠質(zhì)瘤干細(xì)胞系比較,倍增時間明顯縮短,NCH-421k-R無顯著差異。三種GSC-R與親本GSC比較,CD133的表達比例明顯增加。RT-PCR表明GSC-R的干細(xì)胞標(biāo)記物表達增加,侵襲性相關(guān)指標(biāo)MMP-2,MMP-9表達也增加。死亡受體分子TRADD,DR5和抑
8、制凋亡蛋白cFLIP在mRNA水平和蛋白水平的表達均明顯增加,而死亡受體DR4和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2在三種GSC-R中表達水平變化具有異質(zhì)性。
結(jié)論:構(gòu)建成功三種更具有放療抵抗特性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞株。GSC-R的干細(xì)胞特性增強,TRADD,DR5的表達增加。
第三部分TNFR1/TRADD/NF-κB通路與TRAIL/DR5通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療增敏中的作用及其機制
目的:探討TNFR1/TRADD/NF-
9、κB通路與TRAIL/DR5通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療增敏中的作用及其放療增敏的作用機制。
方法:利用PCR apoptosis array對放療后U87和U87-sph的凋亡相關(guān)mRNA水平表達變化進行測定。通過REMBRANDT數(shù)據(jù)庫查找TRADD基因在膠質(zhì)瘤中表達情況及其和預(yù)后的關(guān)系。Western blot測定正常組織和GBM組織中TRADD的表達。通過RT-PCR和Western blot測定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和對應(yīng)分化細(xì)胞中
10、TRADD和DR5的表達。通過western blot檢測單次8Gy劑量照射后不同時間點U87和U87-sph的死亡受體相關(guān)蛋白,凋亡相關(guān)蛋白及NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達情況。檢測加入不同濃度的NF-κB抑制劑PDTC后,U87和U87-sph的凋亡率變化。比較單純放療,單純 PDTC和PDTC聯(lián)合放療對U87和U87-sph的凋亡的影響,并用Western blot檢測三種處理方式后U87-sph和U251-sph凋亡蛋白和NF-κ
11、B通路蛋白表達水平變化。檢測加入不同濃度的TRAIL后,U87和U87-sph的凋亡率變化,并用Western blot檢測不同濃度TRAIL處理后U87和U87sph凋亡蛋白和NF-κB通路蛋白表達水平變化。比較單純放療,單純TRAIL和TRAIL聯(lián)合放療對U87和U87-sph凋亡的影響,并用Western blot檢測三種處理方式后U87-sph和U251-sph凋亡蛋白和NF-κB通路蛋白表達水平變化。
結(jié)果:通過PC
12、R apoptosis array發(fā)現(xiàn)放療后U87-sph TRADD與DR5 mRNA水平較未處理U87-sph增加較明顯,而在U87中未發(fā)現(xiàn)這種變化。REMBRANDT數(shù)據(jù)庫查找TRADD基因在膠質(zhì)瘤尤其在GBM中表達明顯增加。TRADD過表達病人的生存期明顯較短。通過Western blot驗證了GBM組織中TRADD表達增高。干細(xì)胞中TRADD在mRNA水平和蛋白水平均較分化細(xì)胞表達增加,而DR5趨勢相反。在單次8Gy劑量照射后
13、,U87-sph中TNFR1,TRADD和DR5表達均較分化細(xì)胞增加明顯。U87-sph放療后NF-κB通路活化明顯較分化細(xì)胞強。隨著濃度遞增,U87-sph對TRAIL誘導(dǎo)凋亡敏感性較U87差。而U87-sph和U87對PDTC誘導(dǎo)的凋亡敏感性差異不大。Western blot發(fā)現(xiàn)U87-sph在加入TRAIL后NF-κB通路明顯激活,而U87未見這種變化。PDTC聯(lián)合放療,TRAIL聯(lián)合放療均能明顯增加膠質(zhì)瘤干細(xì)胞U87-sph的凋
14、亡率。Western blot結(jié)果顯示PDTC聯(lián)合放療后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中NF-κB通路明顯被抑制;TRAIL聯(lián)合放療后DR5上調(diào),cFLIP表達下降,而p-NF-κB的表達仍然增加。
結(jié)論:TNFR1/TRADD/NF-κB通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療抵抗中發(fā)揮重要作用。通過TRAIL和NF-κB抑制劑PDTC均能明顯增加膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對放療的敏感性。其中PDTC通過抑制NF-κB通路發(fā)揮作用,而TRAIL聯(lián)合放療增加放療敏感性的機制可
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