SHH信號通路對腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖與分化調(diào)控作用的實驗研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的一種原發(fā)惡性腦腫瘤，也是目前為止中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療效果最差的腫瘤之一。腦膠質(zhì)瘤治療的最大困難在于復發(fā)，這與膠質(zhì)瘤細胞的無限增殖能力和侵襲性生長有關(guān)。腦膠質(zhì)瘤干細胞僅占膠質(zhì)瘤細胞成分中的少部分，能自我更新和增殖、分化形成與親本形態(tài)和分子表型相同的腫瘤細胞，連續(xù)移植均能形成與親本相同的腫瘤，是形成不同分化程度膠質(zhì)瘤細胞的“種子”細胞，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)中起決定性作用，因此，本實驗選擇人腦膠質(zhì)瘤干細胞作為細胞模型。

2、 近年來通過對HH信號通路的深入研究，發(fā)現(xiàn)HH信號的異常與人類腫瘤形成有密切的聯(lián)系。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)sHH信號通路的異常激活，使用抑制劑阻斷sHH信號通路可抑制腫瘤的生長。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中HH信號通路的異常激活可能導致腦腫瘤形成，使用SHH信號通路的特異性抑制劑環(huán)杷明(Cyclopamine)能阻止多種原代膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤及膠質(zhì)瘤細胞株的生長。HH信號通路在腦腫瘤特別是腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生中起重要作用，一些膠質(zhì)瘤和髓母細胞瘤以及相應(yīng)的模

3、型系統(tǒng)的維持和存活需要sHH信號通路信號；SHH信號通路可能參與了膠質(zhì)瘤的啟動，而且通常作用于神經(jīng)前體細胞或有神經(jīng)干細胞特性的細胞。HH信號通常通過GLI-1發(fā)揮作用，GLI-1的表達是細胞對Hh信號傳導發(fā)生反應(yīng)的一個可靠標志，其升高水平可能與腫瘤的級別有關(guān)。HH信號也可通過細胞周期因子、抗凋亡因子BCL2以及調(diào)控或與其他信號通路如Notch通路協(xié)同作用等發(fā)揮調(diào)控作用，影響腫瘤細胞的增殖和存活。 鑒于SHH信號通路在NSC或神經(jīng)

4、前體細胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用，而在包括髓母細胞瘤在內(nèi)的膠質(zhì)瘤和其它多種腫瘤組織及細胞系中也發(fā)現(xiàn)sHH信號通路的異?；罨?，我們推測在膠質(zhì)瘤的種子細胞膠質(zhì)瘤干細胞中應(yīng)該也有SHH信號的異常變化并可能對膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，但是究竟如何變化?這些變化又是通過何種機制決定膠質(zhì)瘤干細胞的命運及調(diào)控其增殖、分化等生物學行為?目前國內(nèi)外尚未見報導，值得進一步深入研究。 在本課題中，在第一部分實驗中采用以CD133為標志的

5、免疫磁珠法從人腦膠質(zhì)瘤組織和細胞株中分離腦膠質(zhì)瘤干細胞并進行體外培養(yǎng)，通過免疫熒光技術(shù)檢測干細胞標志物CD133、Nestin，誘導分化后檢查分化細胞標志物MAP2、GFAP、MBP以及電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察和移植SCID鼠致瘤實驗，對其干細胞特性加以鑒定，得到如下結(jié)果：不同病理分級的新鮮膠質(zhì)瘤標本和膠質(zhì)瘤細胞株中存在一小部分CD133+的膠質(zhì)瘤細胞，能表達干細胞的標志物CD133和Nestin，符合干細胞的超微結(jié)構(gòu)特點，體外培養(yǎng)能連續(xù)傳代；

6、具有多向分化潛能：誘導分化后能產(chǎn)生MAP2、β-TrubulinⅢ、GFAP、MBP染色陽性的細胞；移植SCID鼠后能形成與親本腫瘤表型一致的移植瘤。因此，這一小部分CD133+膠質(zhì)瘤細胞具有干細胞的屬性，就是膠質(zhì)瘤中的腫瘤干細胞，即膠質(zhì)瘤干細胞。 在第二部分實驗中，采用體外分離培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤干細胞作為細胞模型，首先研究膠質(zhì)瘤干細胞增殖、分化培養(yǎng)過程中SHH信號通路基因和蛋白的表達情況，以及腦膠質(zhì)瘤組織和細胞株中的蛋白表達情況及細

7、胞類型，并分析與腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖、分化的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了針對人SHH基因的RNA干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制腦膠質(zhì)瘤干細胞中SHH信號通路的表達和作用，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、RT-PCR、Western Blot和流式細胞術(shù)等檢測對體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖、分化、存活以及移植SCID鼠后致瘤能力的影響，得到如下結(jié)果： 1、腦膠質(zhì)瘤組織和細胞株中有Shh、Gli-1和Bmi-1表達，而正常成人腦組織中則未能檢

8、測到；Shh和Gli-1在高級別膠質(zhì)瘤組織中的表達強于低級別膠質(zhì)瘤組織中；Bmi-1表達與膠質(zhì)瘤病理分級無明顯關(guān)系。 2、Shh和Gli-1表達于相對分化而又未完全成熟的MAP2、GFAP和MBP陽性細胞中，發(fā)育較成熟的細胞中表達極弱或檢測不到；CD133陽性細胞中未檢測到，提示Shh和Gli-1表達可能與膠質(zhì)瘤細胞分化啟動和維持有關(guān)，而且沒有明顯細胞特異性。 3、CD133、MAP2、GFAP和MBP陽性細胞中均檢測到

9、了Bmi-1，CD133和MAP2陽性細胞表達強于GFAP和MBP陽性細胞；Bmi-1在相對幼稚細胞中表達強于相對成熟細胞，提示Bmi-1強表達可能與膠質(zhì)瘤細胞未分化或低分化狀態(tài)維持有關(guān)。 4、膠質(zhì)瘤干細胞增殖過程未檢測到SHH基因mRNA和蛋白表達，GLI-1基因mRNA和蛋白呈弱表達，而BMI-1基因mRNA和蛋白呈強表達，提示在腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖過程中有極低水平的Gli-1信號維持作用，可能與干細胞狀態(tài)和細胞存活維持有關(guān)。

10、 5、膠質(zhì)瘤干細胞分化時SHH和GLI-1基因mRNA及蛋白表達呈逐漸增強，然后逐漸減弱至消失的過程，CD133表達逐漸減弱，MAP2、GFAP和MBP出現(xiàn)表達并逐漸增強，提示SHH信號通路表達可能參與了膠質(zhì)瘤干細胞分化啟動和階段性調(diào)控作用。 6、成功構(gòu)建了pSiRNA-SHH和pSiRNA-NC，并經(jīng)PT 67細胞包裝后生成了相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 7、對SHH信號通路進行RNAi后，膠質(zhì)瘤干細胞增殖受到抑制，

11、存活細胞減少；G0/G1期細胞減少，S期細胞出現(xiàn)耗竭或被阻滯于S期，凋亡/壞死細胞增加，提示SHH信號通路對膠質(zhì)瘤干細胞增殖、細胞分裂和存活有促進作用，該作用可能是通過調(diào)控細胞周期以促進細胞分裂、減少細胞凋亡/壞死實現(xiàn)的。 8、對SHH信號通路RNAi后，腦膠質(zhì)瘤干細胞分化受到抑制，死亡細胞明顯增加，培養(yǎng)的第3d干擾組中CD133、β-Fubulin Ⅲ、GFAP和MBP陽性細胞所占比例均明顯升高，提示細胞被阻滯于能同時表達上述

12、標志物的特定多能干細胞階段，說明SHH信號通路促進膠質(zhì)瘤干細胞分化和存活。 9、經(jīng)RNAi-SHH處理后的膠質(zhì)瘤干細胞移植SCID鼠后8周未見腫瘤形成，而未經(jīng)處理的同種細胞在低2個數(shù)量級情況下移植也導致腫瘤形成，提示RNAi-SHH對腦膠質(zhì)瘤干細胞移植后致瘤能力產(chǎn)生抑制，但有待更多數(shù)量動物原位實驗加以驗證。 總之，通過本課題的研究，結(jié)果表明：SHH信號通路的基因和蛋白在腦膠質(zhì)瘤的增殖、分化和存活的過程中同樣表達并發(fā)揮重要

13、的調(diào)控作用，不僅促進腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖和存活，同樣也促進并調(diào)控腦膠質(zhì)瘤干細胞的分化過程和存活，該作用可能是通過調(diào)控細胞周期以促進細胞分裂、減少細胞凋亡/壞死實現(xiàn)的。 同時應(yīng)看到，SHH信號僅僅是膠質(zhì)瘤增殖、分化和存活中起關(guān)鍵作用的信號通路之一，其他的信號通路如Notch、WNT、EGF、bFGF信號通路可能也對膠質(zhì)瘤增殖、分化和存活起著重要作用，因此，很可能是眾多信號通路協(xié)同作用，共同完成對膠質(zhì)瘤干細胞增殖分化和存活的綜合調(diào)控