Let-7a在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的功能研究.pdf

1、目的:
　　探究let-7a在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)中的功能及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　首先通過向細(xì)胞轉(zhuǎn)染人工合成的let-7a(let-7a mimics)上調(diào)let-7a表達(dá)量，檢測(cè)過表達(dá)let-7a對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87增殖、遷移、侵襲及GSCs增殖和自我更新的影響。采用無血清培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)和培養(yǎng)GSCs，并通過免疫熒光染色進(jìn)行干細(xì)胞鑒定。運(yùn)用q-PCR檢測(cè)細(xì)胞中l(wèi)et-7a的表達(dá)水平

2、，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)let-7a對(duì)U251，U87和GSCs增殖的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell分別用來檢測(cè)let-7a對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。運(yùn)用干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)分析let-7a對(duì)GSCs自我更新的影響。隨后，我們通過生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)let-7a靶基因進(jìn)行鑒定。Western blot用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)E2F2和IMP2的蛋白表達(dá)。緊接著通過siRNA-E2F2下調(diào)U251U87和GSCs中E2F2的表

3、達(dá)水平，CCK-8實(shí)驗(yàn)和干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)E2F2下調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖和GSCs自我更新能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1、在轉(zhuǎn)染后48h，q-PCR檢測(cè)U251和U87及GSCs中l(wèi)et-7a表達(dá)情況，與miR-NC組相比，let-7amimics組let-7a表達(dá)量被明顯上調(diào)。
　　2、過表達(dá)let-7a抑制U251和U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。
　　3、過表達(dá)let-7a抑制U251-GSC和U87-GSC的

4、增殖和自我更新。
　　4、生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，E2F2和IMP2為let-7a的候選靶基因，q-PCR和westernblot分析表明:過表達(dá)let-7a，在U251，U87，U251-GSC和U87-GSC中E2F2的mRNA和蛋白水平均下調(diào)，而IMP2的mRNA和蛋白水平在U251和U87中下調(diào)，在U251-GSC和U87-GSC中沒有明顯變化。
　　5、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，過表達(dá)let-7a能夠降低含有野生型E

5、2F23'UTR序列的載體熒光素酶活性，表明E2F2為let-7a的直接靶點(diǎn)。
　　6、通過轉(zhuǎn)染siRNA-E2F2下調(diào)U251和U87及GSCs中E2F2的蛋白表達(dá)，E2F2下調(diào)抑制U251和U87的增殖及U251-GSC和U87-GSC的自我更新能力。
　　結(jié)論:
　　過表達(dá)let-7a能夠降低U251和U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時(shí)過表達(dá)let-7a可以抑制GSCs的增殖和自我更新，E2F2作為let-7