B7-H1-PD-1在人結(jié)腸癌中的表達(dá)及其與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞關(guān)系的研究.pdf

1、本文分二部分：
　　 第一部分：目的：分析B7-H1和PD-1分子在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平，并分析結(jié)腸癌微環(huán)境中異常增高的Treg與B7-H1的關(guān)系。
　　 方法：利用Western Blot和流式細(xì)胞技術(shù)研究結(jié)腸癌患者手術(shù)切除的癌組織及癌旁正常組織中B7-H1及PD-1的表達(dá)情況；使用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中浸潤Treg量的差異；使用Western Blot技術(shù)檢測結(jié)腸癌組織中提取的Treg與CD4+C

2、D25-T細(xì)胞所表達(dá)IL-10的水平差異；免疫磁珠分選健康人外周血中分選的CD4+CD25+和CD4+CD25-細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并用anti-CD3和anti-CD28刺激，ELISA檢測培養(yǎng)體系中IL-10的表達(dá)量；免疫磁珠分選人結(jié)腸癌中浸潤的Treg細(xì)胞，與從健康人外周血分選的單核細(xì)胞共培養(yǎng)，流式檢測單核細(xì)胞表達(dá)B7-H1的水平；經(jīng)Treg誘導(dǎo)高表達(dá)B7-H1的單核細(xì)胞和從結(jié)腸癌組織中分選的巨噬細(xì)胞與健康人外周血分選的Na(o)ve

3、 T細(xì)胞共培養(yǎng)，CFSE法測定T細(xì)胞的增殖情況，以測定經(jīng)Treg誘導(dǎo)高表達(dá)B7-H1的單核細(xì)胞對T細(xì)胞的免疫抑制能力。
　　 結(jié)果：1．Western Blot結(jié)果顯示結(jié)腸癌患者癌組織及癌旁正常組織均表達(dá)B7-H1分子，且癌組織比癌旁正常組織中B7-H1表達(dá)水平高；
　　 2．流式細(xì)胞儀檢測顯示B7-H1主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞，且癌組織比癌旁正常組織浸潤的巨噬細(xì)胞表達(dá)的B7-H1的水平高，比例分別為38±4％和5±2％；平均

4、熒光強(qiáng)度（MFI）分別為1900±20和250±100；
　　 3．流式細(xì)胞儀檢測顯示PD-1主要表達(dá)于CD8+T細(xì)胞，癌組織比癌旁正常組織浸潤的CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平高，比例分別為51±6％和6±2％；
　　 4．將從結(jié)腸癌組織中分選的巨噬細(xì)胞分別與健康人外周血分選的經(jīng)CFSE染色
　　 第二部分：目的：分析B7-H1和PD-1分子在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平，并分析結(jié)腸癌微環(huán)境中異常增高的Treg與B7

5、-H1的關(guān)系。
　　 方法：利用Western Blot和流式細(xì)胞技術(shù)研究結(jié)腸癌患者手術(shù)切除的癌組織及癌旁正常組織中B7-H1及PD-1的表達(dá)情況；使用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中浸潤Treg量的差異；使用Western Blot技術(shù)檢測結(jié)腸癌組織中提取的Treg與CD4+CD25-T細(xì)胞所表達(dá)IL-10的水平差異；免疫磁珠分選健康人外周血中分選的CD4+CD25+和CD4+CD25-細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并用anti-C

6、D3和anti-CD28刺激，ELISA檢測培養(yǎng)體系中IL-10的表達(dá)量；免疫磁珠分選人結(jié)腸癌中浸潤的Treg細(xì)胞，與從健康人外周血分選的單核細(xì)胞共培養(yǎng)，流式檢測單核細(xì)胞表達(dá)B7-H1的水平；經(jīng)Treg誘導(dǎo)高表達(dá)B7-H1的單核細(xì)胞和從結(jié)腸癌組織中分選的巨噬細(xì)胞與健康人外周血分選的Na(o)ve T細(xì)胞共培養(yǎng)，CFSE法測定T細(xì)胞的增殖情況，以測定經(jīng)Treg誘導(dǎo)高表達(dá)B7-H1的單核細(xì)胞對T細(xì)胞的免疫抑制能力。
　　 結(jié)果：1．

7、Western Blot結(jié)果顯示結(jié)腸癌患者癌組織及癌旁正常組織均表達(dá)B7-H1分子，且癌組織比癌旁正常組織中B7-H1表達(dá)水平高；
　　 2．流式細(xì)胞儀檢測顯示B7-H1主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞，且癌組織比癌旁正常組織浸潤的巨噬細(xì)胞表達(dá)的B7-H1的水平高，比例分別為38±4％和5±2％；平均熒光強(qiáng)度（MFI）分別為1900±20和250±100；
　　 3．流式細(xì)胞儀檢測顯示PD-1主要表達(dá)于CD8+T細(xì)胞，癌組織比癌旁正常

8、組織浸潤的CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平高，比例分別為51±6％和6±2％；
　　 4．將從結(jié)腸癌組織中分選的巨噬細(xì)胞分別與健康人外周血分選的經(jīng)CFSE染色的Na(o)ve T細(xì)胞共培養(yǎng)，流式檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)高表達(dá)B7-H1的單核細(xì)胞或結(jié)腸癌來源的巨噬細(xì)胞組T細(xì)胞增殖功能(CFSEdim：30±5％)較對照組(Na(o)ve T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組CFSEdim：63±7％、癌旁正常組織與Na(o)ve T細(xì)胞共培養(yǎng)組CFSEdim：

9、55±8％)明顯受抑制，阻斷B7-H1通路后受抑狀態(tài)可以得到恢復(fù)（加入B7-H1阻斷性抗體組CFSEdim：51±10％、加入PD-1阻斷性抗體組CFSEdim：54±11％）；
　　 5．流式細(xì)胞儀檢測顯示結(jié)腸癌組織中浸潤的Treg較癌旁正常組織增多，F(xiàn)oxp3+Treg占CD3+CD4+細(xì)胞中的比例分別為18±5％和5±3％；
　　 6．Western Blot檢測從結(jié)腸癌組織中分選的CD4+CD25+細(xì)胞比CD4+

10、CD25-細(xì)胞表達(dá)的IL-10高；將健康人外周血液中分選的CD4+CD25+和CD4+CD25-細(xì)胞分別進(jìn)行體外培養(yǎng)并用CD3、CD28刺激48小時(shí)后，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+細(xì)胞組表達(dá)IL-10的濃度明顯高于CD4+CD25-細(xì)胞組，濃度分別為180±27pg/ml、52±9pg/ml；
　　 7．分選腫瘤組織中Treg與健康人外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，流式檢測發(fā)現(xiàn)Treg與單核細(xì)胞共培養(yǎng)組B7-H1表達(dá)量（比例：28

11、±3％；MFI：1200±80）明顯高于對照組（比例：5±1％；MFI：150±20）和加入IL-10拮抗性抗體組（比例：6±2％；MFI：350±50）；
　　 8．將經(jīng)Treg誘導(dǎo)高表達(dá)B7-H1的單核細(xì)胞與健康人外周血分選的經(jīng)CFSE染色的Na(o)ve T細(xì)胞共培養(yǎng)，流式檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)高表達(dá)B7-H1的單核細(xì)胞組T細(xì)胞增殖功能(CFSEdim：32±8％)較對照組(Na(o)ve T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組CFSEdim：60±7

12、％、外周血未經(jīng)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞與Na(o)ve T 共培養(yǎng)組CFSEdim：64±11％)明顯受抑制，阻斷B7-H1通路后受抑狀態(tài)可以得到恢復(fù)（加入B7-H1阻斷性抗體組CFSEdim：52±8％、加入PD-1阻斷性抗體組CFSEdim：55±5％）經(jīng)Treg誘導(dǎo)高表達(dá)B7-H1是可以通過B7-H1/PD-1途徑抑制T細(xì)胞增殖的。
　　 結(jié)論：1．結(jié)腸癌微環(huán)境中巨噬細(xì)胞高表達(dá)B7-H1；結(jié)腸癌組織浸潤性CD8+T細(xì)胞高表達(dá)PD-1