2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩143頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, As)相關(guān)心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率正逐年升高,其防治成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題。As的發(fā)病過程十分復(fù)雜,近年來,As是一種炎癥疾病的觀點(diǎn)越來越受研究者所重視,血管壁炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是As發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。載脂蛋白A1(apolipoprotein A-I, apoA-I)是血漿高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)的主要成分,參與體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)

2、運(yùn)(reverse cholesterol transport, RCT),因此具有抗As的作用。近來研究發(fā)現(xiàn),HDL/apoA-I除了參與RCT外,還具有顯著的抗炎效應(yīng),其機(jī)制研究對(duì)于明確As的慢性炎癥疾病特點(diǎn)及其防治具有重要意義。
  三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)是以ATP為能源,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇(free cholesterol,F(xiàn)C)和

3、磷脂流出并轉(zhuǎn)運(yùn)至貧脂apoA-I,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡的一種整合膜蛋白。研究顯示,ABCA1基因敲除(ABCA1-KO)鼠相對(duì)于野生鼠,除了在 As斑塊中有更嚴(yán)重的脂質(zhì)蓄積外還存在更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而且,敲除或干擾ABCA1基因表達(dá)后HDL/apoA-I調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的效應(yīng)明顯消失或降低,提示ABCA1主要介導(dǎo)了 HDL/apoA-I的抗炎效應(yīng)。前期研究顯示,apoA-I/ABCA1的結(jié)合具有類似于配體/受體結(jié)合的高飽和性和

4、親和性。當(dāng)apoA-I與ABCA1結(jié)合后可迅速激活巨噬細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)途徑,例如雙面神激酶2(Janus kinase2,JAK2),環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和Rho家族小G蛋白CDC42等。活化JAK2通常進(jìn)一步激活信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STATs)家族蛋白,而JAK2/STA

5、Ts信號(hào)途徑是介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核,從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在巨噬細(xì)胞中,JAK2/STAT3信號(hào)途徑被證實(shí)具有重要的抗炎作用,過表達(dá)STAT3或IL-10均可通過激活STAT3而抑制巨噬細(xì)胞多種炎癥因子的表達(dá)。
  生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,ABCA1蛋白質(zhì)胞內(nèi)環(huán)的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding domain,NBD)存在2個(gè)STAT3的激活位點(diǎn) YXXQ基序(924-927和1990

6、-1993),提示apoA-I與ABCA1結(jié)合后可能迅速激活巨噬細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)途徑。因此,本研究從apoA-I/ABCA1特殊的配體/受體結(jié)合功能入手,觀察 HDL及其主要成分 apoA-I對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響,探討ABCA1介導(dǎo)apoA-I調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的胞內(nèi)信號(hào)途徑及其分子機(jī)制,并在體內(nèi)明確apoA-I抗As炎癥激活的效應(yīng)及其作用機(jī)制。
  第一

7、部分apoA1對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及調(diào)節(jié)方式
  目的:觀察HDL及其不同成分對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響,并觀察apoA-I調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用方式。
  方法:培養(yǎng)THP-1細(xì)胞株,用160nmol/L的佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)刺激細(xì)胞12h,使其誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞,并以50mg/L的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low

8、 density lipoprotein,oxLDL)孵育細(xì)胞使其轉(zhuǎn)化為THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。以 HDL(30μg/ml)及其主要成分 apoA-I(10μg/ml)、載脂蛋白B(apolipoprotein B,apoB)(10μg/ml)、卵磷脂(phosphatidyl-choline,PC)(25μg/ml)和膽固醇(cholesterol, CHO)(50ng/ml)分別預(yù)處理細(xì)胞3h后,用LPS(10ng/ml)處

9、理細(xì)胞6h,采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blotting)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、單核細(xì)胞趨化因子1(monocyte chemotactic factor, MCP-1)、干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、IL-6和環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,

10、COX-2)的表達(dá)。提取人外周血單核細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞,oxLDL(50mg/L)孵育過夜后用apoA-I(10μg/ml)和/或LPS(10ng/ml)處理細(xì)胞。構(gòu)建含 TNF-α啟動(dòng)子的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)報(bào)告基因,轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞,采用ELISA法觀察apoA-I對(duì)LPS誘導(dǎo)TNF-α轉(zhuǎn)錄活性的影響;采用Western-blotting觀察apoA

11、-I對(duì)LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞IkBα磷酸化(p-IkBα)和核內(nèi)p65 NF-kB表達(dá)的影響;不同處理因素處理細(xì)胞3h,加入放線菌素D(actinomycin D, Act D)終止轉(zhuǎn)錄,采用定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞TNF-α等多種炎癥因子mRNA的表達(dá)。
  結(jié)果:HDL和 apoA-I預(yù)處理 THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞3h后,LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β、MCP-1、IFN-γ和IL-6的表達(dá)明顯減少,C

12、OX-2的表達(dá)無明顯變化;HDL的其他成分apoB、PC和CHO對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞炎癥因子表達(dá)無明顯影響。ApoA-I預(yù)處理人外周血巨噬細(xì)胞3h后顯著降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α的表達(dá)。apoA-I并不明顯影響LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的TNF-α啟動(dòng)子活性、p-IkBα和核內(nèi)p65 NF-kB表達(dá)的水平。Act D終止轉(zhuǎn)錄后,apoA-I預(yù)處理明顯降低不同時(shí)間點(diǎn)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL

13、-1β、MCP-1和IL-6的mRNA表達(dá)量,提示其促進(jìn)了炎癥因子的mRNA降解。
  結(jié)論:①apoA-I抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞多種炎癥因子的表達(dá);②apoA-I主要通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)炎癥因子mRNA穩(wěn)定性抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)。
  第二部分 apoA-I抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制
  目的:探討apoA-I抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制。
  方法:培養(yǎng) THP-1巨噬細(xì)胞

14、源性泡沫細(xì)胞模型和人外周血巨噬細(xì)胞。以apoA-I和/或LPS處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞或人外周血巨噬細(xì)胞,采用Western-blotting和/或免疫熒光細(xì)胞化學(xué)等方法檢測(cè)鋅指蛋白36(Tristetraprolin,TTP)、人抗原R(Human antigen R,HuR)、磷酸化JAK2和STATs的表達(dá)。分別使用JAK2/STAT3信號(hào)途徑抑制劑AG490,STAT3、ABCA1和TTP小RNA干擾(siRNA)處理

15、細(xì)胞,以實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA等方法分別檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。采用RNA-EMSA法檢測(cè)蛋白質(zhì)是否與TNF-α3`非翻譯區(qū)(3`-untranslated regions,3`-UTR)AU重復(fù)序列(AU-rich elements,ARE)形成蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
  結(jié)果:apoA-I明顯上調(diào)LPS刺激下THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞和人外周血巨噬細(xì)胞TTP的表達(dá),對(duì)HuR的表達(dá)沒有明顯影響;TTP

16、 siRNA下調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞TTP的表達(dá),并明顯抑制apoA-I下調(diào)炎癥因子表達(dá)和促進(jìn)炎癥因子mRNA降解的作用。RNA-EMSA結(jié)果顯示,apoA-I促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與ARE探針形成復(fù)合物,加入TTP抗體形成supershift帶。ApoA-I迅速促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞JAK2和STAT3磷酸化,核內(nèi)STAT3表達(dá)增加,STAT1和STAT6的磷酸化不受影響;AG490和STAT3 siRNA抑制JAK2、STAT

17、3磷酸化,并明顯抑制apoA-I對(duì)TTP表達(dá)的上調(diào)作用。ABCA1 siRNA下調(diào)ABCA1的表達(dá),并明顯抑制apoA-I對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞STAT3磷酸化和TTP表達(dá)的上調(diào)作用,也抑制了apoA-I促進(jìn)TNF-αmRNA降解的效應(yīng)。
  結(jié)論:①apoA-I/ABCA1通過JAK2/STAT3信號(hào)途徑上調(diào)LPS刺激下人巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞TTP的表達(dá);②apoA-I通過TTP促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞炎癥因

18、子mRNA的降解。
  第三部分 apoA-I對(duì)apoE-/-小鼠血管壁炎癥反應(yīng)及As病變的影響及機(jī)制
  目的:以apoE基因敲除(apoE-KO)小鼠為研究對(duì)象,觀察過表達(dá)人apoA-I對(duì)LPS誘導(dǎo)apoE-KO小鼠動(dòng)脈粥樣硬化(As)病變、血管壁巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子表達(dá)的影響,并在體內(nèi)探討其相關(guān)分子機(jī)制。
  方法:20周齡雄性apoE-KO小鼠以普通飼料飼養(yǎng),并隨機(jī)分為四組:對(duì)照組、LPS組、LPS+apoA

19、Ⅰ過表達(dá)組和LPS+GFP過表達(dá)組(每組20只)。其中,對(duì)照組每天皮下注射與實(shí)驗(yàn)組同等劑量的生理鹽水;LPS組每天皮下注射 LPS(25μg/只);LPS+apoAⅠ過表達(dá)組除給予LPS處理外,通過尾靜脈注射2型腺相關(guān)病毒 rAAV2-apoAⅠ-GFP(1×1011v.p./只);LPS+GFP過表達(dá)組除給以 LPS處理外,通過尾靜脈注射2型腺相關(guān)病毒rAAV2-GFP(1×1011v.p./只)。4周后處死動(dòng)物,采用肝臟組織熒光檢測(cè)

20、、熒光定量PCR法和Western-blotting法檢測(cè)肝臟中人apoA-I mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平;免疫比濁法檢測(cè)血清中人apoA-I的表達(dá)水平。采用酶氧化法檢測(cè)甘油三酯、總膽固醇等血脂水平;ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子(TNF-α、IL-1β和MCP-1等)的表達(dá);HE染色法觀察主動(dòng)脈竇動(dòng)脈粥樣硬化病變情況;油紅 O染色觀察主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇處脂質(zhì)蓄積情況;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物 CD68的表達(dá);熒光定量 PCR和/或

21、Western-blotting法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈ABCA1、TTP、p-JAK2和p-STAT3 mRNA和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)。提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,檢測(cè)TTP和炎癥因子mRNA的降解情況。
  結(jié)果:肝臟組織熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,rAAV2注射后4周仍可檢測(cè)到 GFP表達(dá);熒光定量PCR和Western-blotting法結(jié)果顯示,apoA-Ⅰ過表達(dá)組小鼠肝臟中人apoA-Ⅰ的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯升高;免疫比濁法顯示apoA-Ⅰ過

22、表達(dá)組小鼠血清中存在人apoA-Ⅰ的表達(dá),而GFP過表達(dá)組未檢測(cè)到人apoA-Ⅰ。與對(duì)照組比較,LPS組小鼠血漿HDL水平降低,其他脂質(zhì)成分無明顯改變,但TNF-α、IL-1β和MCP-1等炎癥因子的水平明顯升高,主動(dòng)脈竇處As病變面積增大,主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇部脂質(zhì)含量增加,主動(dòng)脈炎癥因子水平明顯升高,主動(dòng)脈竇部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯;與LPS組小鼠比較,LPS+apoA-Ⅰ過表達(dá)組小鼠的HDL-膽固醇和總膽固醇明顯增加,血漿炎癥因子的水平明顯

23、降低,主動(dòng)脈竇處As病變明顯減輕,主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇部脂質(zhì)含量明顯減少,主動(dòng)脈炎癥因子水平明顯降低,主動(dòng)脈竇部巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,主動(dòng)脈ABCA1、p-JAK2、p-STAT3和TTP的表達(dá)明顯增加。相對(duì)于LPS組,LPS+ apoA-Ⅰ過表達(dá)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 TTP的表達(dá)明顯增加,TNF-α和 IL-1β的mRNA降解率增快。相對(duì)于 LPS組,LPS+GFP過表達(dá)組小鼠上述指標(biāo)無明顯變化。
  結(jié)論:①過表達(dá)人apoA-Ⅰ抑制

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論