白蛋白致腎小管間質(zhì)損害研究.pdf

1、蛋白尿致腎損害的機理尚未完全清楚。目前較一致的觀點認為，蛋白尿可能是通過引起腎小管間質(zhì)損害而影響腎小球疾病進展的。白蛋白是尿蛋白中最主要的成分。研究表明，大劑量白蛋白對腎小管上皮細胞存在直接損害作用。在體外，白蛋白超載腎小管上皮細胞可誘導腎小管上皮細胞表達一系列生長因子和前炎癥因子，其中包括介導腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化最重要的因子——轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)。但是白蛋白超載誘導的這些細胞因子必須穿越腎小管基底膜進入到腎間質(zhì)才有可能

2、介導腎間質(zhì)損害和纖維化?；|(zhì)金屬蛋白酶-2和-9(MMP-2和MMP-9)是可以降解Ⅳ型、Ⅴ型膠原和層粘連蛋白等的酶類，被認為在影響基底膜結(jié)構(gòu)的完整性中起重要作用。過度表達的MMP-2和MMP-9與腎小管基底膜的破壞和腎間質(zhì)纖維化相關(guān)。而TGF-β可以誘導腎小管上皮細胞表達MMP-2和MMP-9。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，在腎臟纖維化的過程中，腎小管上皮細胞可轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞(EMT)，并可以遷移進入到間質(zhì)，成為腎間質(zhì)成肌纖維細胞的主要來源

3、之一。研究發(fā)現(xiàn)，白蛋白超載可以誘導腎小管上皮細胞表達TGF-β，單核細胞趨化因子(MCP-1)和氧自由基(ROS)等，而這些因子在體外被證實可以誘導或促進腎小管細胞向成肌纖維細胞轉(zhuǎn)化。 目的本研究擬通過臨床和實驗研究探討尿蛋白中的主要成分白蛋白致腎小管間質(zhì)損害的機理。臨床研究部分：觀測難治性原發(fā)性腎病綜合征患者蛋白尿與腎小管間質(zhì)損害和腎小球功能損害的關(guān)系，并分析其與病情進展的關(guān)系。實驗研究部分：(一)白蛋白超載腎小管上皮細胞對M

4、MP-2和MMP-9酶活性和蛋白水平的影響。(二)白蛋白超載對腎小管上皮細胞向成肌纖維細胞轉(zhuǎn)型的研究。通過上述研究，進一步了解蛋白尿致腎小管間質(zhì)損害的機理，為臨床防治蛋白尿所致腎臟損害提供進一步的理論依據(jù)。 材料和方法[難治性原發(fā)性腎病綜合征患者蛋白尿與腎小管間質(zhì)損害和腎功能的關(guān)系]1.病例選擇和分組：本院1991年-2005年難治性原發(fā)性腎病綜合癥(包括激素耐藥，激素依賴和頻繁復發(fā))患者，經(jīng)腎活檢病理診斷為輕微病變腎病(MCD

5、)，系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)或局灶節(jié)段腎小球硬化(FSGS)，并符合以下要求者：(1)持續(xù)蛋白尿組(甲組)：腎穿刺前，尿蛋白+以上，持續(xù)6個月以上；偶然可由-～±，但持續(xù)時間不超過2周。(2)間歇性蛋白尿組(乙組)：腎穿刺前，尿蛋白間歇出現(xiàn)，病程6個月以上，無蛋白尿(尿蛋白-～±)在時間占整個病程的一半以上。符合要求病例共49例，男35例，女14；年齡1.4-15歲，病程6-108月，追蹤時間5-92月。持續(xù)蛋白尿組患兒18例

6、，間歇蛋白尿組患兒31例。 2、觀察指標1)、臨床資料：患兒年齡，性別，24小時尿蛋白定量，血肌酐，尿β2-微球蛋白(β2-MG)，尿N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶(NAG)，血白蛋白(ALB)，血膽固醇(CHOL)。 2)、病理資料：腎小管間質(zhì)組織學改變的評價方法，將腎小管間質(zhì)改變分為四級：0級：間質(zhì)正常，腎小管無改變；Ⅰ級，間質(zhì)極少量炎性細胞浸潤，無纖維組織增生，病變＜20％；Ⅱ級，腎小管上皮細胞萎縮，變性，壞死輕，呈灶狀

7、分布，少量炎性細胞浸潤，纖維組織增生，呈小灶狀分布，20％＜病變＜50％；Ⅲ級，腎小管上皮細胞萎縮，變性，壞死重，呈片狀分布，大量炎性細胞浸潤，纖維組織呈多灶狀或彌漫增生，病變＞50％。腎小球病理損害半定量分析按以下幾方面統(tǒng)計：系膜增生程度分級：0級，正常；Ⅰ級，輕度增生；Ⅱ級，中度增生；Ⅲ級，重度增生。節(jié)段性硬化，新月體和球性硬化分別以受累腎小球數(shù)除以送檢腎小球總數(shù)進行校正后的值為實測值。 [白蛋白誘導腎小管上皮細胞向

8、成纖維細胞轉(zhuǎn)化的研究]NRK52E近端小管細胞(PTCs)接種在用Ⅰ型膠原包被的6孔培養(yǎng)板或每孔含有4片蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上。培養(yǎng)PTCs至70％融合(未完全融合)或100％融合(完全融合)時，去血清培養(yǎng)24小時。然后分別給予不同濃度的去脂或非去脂牛血清白蛋白(dBSA/BSA)，濃度范圍：0，0.5，1，5，10，30mg/ml。其中dBSA或BSA0mg/ml為對照細胞。實驗觀察48，72和144小時。部分實驗觀察192小時。PTC

9、s形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變用光鏡和電鏡觀測。上皮細胞標記抗原：E-鈣粘蛋白和β-連環(huán)蛋白，以及成肌纖維細胞標記抗原：α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達用免疫熒光和Western印跡法檢測。同時觀測細胞增殖(用MTT，即四甲基偶氮唑鹽，比色法)和細胞凋亡(用末端標記法，即TUNEL法，DNA梯帶和苔盼藍染色法)。 結(jié)果[難治性原發(fā)性腎病綜合征患者蛋白尿與腎小管間質(zhì)損害和腎功能的關(guān)系]1.尿蛋白與腎小管間質(zhì)損害、腎小球病理損害和腎功能的關(guān)

10、系。持續(xù)蛋白尿患兒腎間質(zhì)病理損害(平均秩和：33.44)較間歇性蛋白尿患兒的(平均秩和：20.10)嚴重，差異有顯著性，P＜0.05。兩組患兒腎小球病理損害比較，除了系膜增生程度兩組間比較(平均秩和：29.67比22.29)差異有顯著性外，P＜0.05。球性硬化，節(jié)段硬化和新月體程度，兩組比較差異均無顯著性。臨床觀察指標的比較，兩組患兒血肌酐(147.62±214.97umol/L比59.84±64.64umol/L)、血BUN(12.

11、64±9.13mmol/L比7.01±7.02mmol/L)和β2-MG(1776±1004ug/L比694.80±1135ug/L)比較差異有顯著性，P＜0.05。但兩組患兒血白蛋白、血膽固醇、24小時尿蛋白定量和尿NAG的差異無顯著性，P＞0.05。 2.腎小管間質(zhì)損害與腎小球病理損害和腎功能的關(guān)系由于腎小管間質(zhì)病理損害Ⅱ級和Ⅲ級的病例數(shù)較少，兩組合并后再進行統(tǒng)計比較。結(jié)果，腎小管間質(zhì)病理損害Ⅱ+Ⅲ級患兒球性硬化(平均秩和：

12、35.83)較Ⅰ級(22.79)和0級(22.48)患兒高，差異均有顯著性，P＜0.05。腎小管間質(zhì)病理損害Ⅱ+Ⅲ級患兒系膜增生程度(平均秩和：35.83)較0級患兒(22.63)高，差異有顯著性，P＜0.05。節(jié)段硬化和新月體程度，在腎小管間質(zhì)病理損害各分組間的差異均無顯著性，P＞0.05。腎小管間質(zhì)病理損害各分級患兒的臨床觀測指標比較，腎小管間質(zhì)病理損害Ⅱ+Ⅲ級患兒血肌酐(198.40±95.74umol/L)、血BUN(16.88

13、±9.43mmol/L)和β2-MG(2797.25±2055.32ug/L)和Ⅰ級血肌酐(125.59±94.56umol/L)、血BUN(11.00±9.73mmol/L)和β2-MG(926.32±826.59ug/L)較0級患兒血肌酐(43.60±16.86umol/L)、血BUN(5.93±4.91mmol/L)和β2-MG(6363.34±525.81ug/)升高，差異均有顯著性，P＜0.05；其中β2-MG，Ⅱ+Ⅲ級患兒又

14、較Ⅰ級患兒高，差異有顯著性，P＜0.05。但血白蛋白、血膽固醇、24小時尿蛋白定量和尿NAG各組間比較差異無顯著性，P＞0.05。 3.尿蛋白及腎小管間質(zhì)病理損害與病情進展的關(guān)系持續(xù)蛋白尿(甲組)和間歇蛋白尿(乙組)患兒追蹤前后腎功能變化比較，兩組忠兒追蹤后的血肌酐和血BUN均較追蹤前高，但差異均無顯著性，P＞0.05。這可能與病例數(shù)較少有關(guān)。腎間質(zhì)損害各分級患兒追蹤前后腎功能變化的比較，腎小管間質(zhì)病理損害Ⅰ級，或Ⅱ+Ⅲ級患兒，

15、追蹤后血肌酐較追蹤前升高(Ⅰ級分別為：61.25±19.25umol/L，47.75±13.67umol/L；Ⅱ+Ⅲ級分別為：411.00±268.62umol/L，122.40±64.21umol/L)，差異均有顯著性，P＜0.05。腎小管間質(zhì)病理損害0級患兒，追蹤后血肌酐較追蹤前(54.50±25.54umol/L，40.33±12.96umol/L)升高，但差異無顯著性，P＞0.05。提示有腎小管間質(zhì)病理損害者，病情進展快。腎間質(zhì)

16、損害各分級患兒追蹤后血BUN較追蹤前有所升高，但差異無顯著性，P＞0.05。 結(jié)論1.在難治性原發(fā)性腎病綜合征患兒，蛋白尿與腎小管間質(zhì)損害和腎功能損害相關(guān)，腎間質(zhì)損害與腎功能損害和病情進展相關(guān)。尿蛋白可能影響腎小球疾病的進展和預(yù)后。 2.白蛋白超載PTCs可上調(diào)MMP-2和MMP-9。在蛋白尿誘發(fā)的腎小管間質(zhì)損害中，白蛋白超載誘導PTCs產(chǎn)生的MMP-2和MMP-9可能對TBM起破壞作用。 3.在白蛋白超載的