低氧誘導(dǎo)因子1α在白蛋白過負(fù)荷致腎小管上皮細(xì)胞損傷中作用的研究.pdf

1、持續(xù)低氧狀態(tài)促進(jìn)腎臟纖維化進(jìn)展的觀點(diǎn)已被學(xué)界廣泛接受。低氧促進(jìn)CKD進(jìn)展的作用主要通過低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor,HIF)/低氧反應(yīng)元件(hypoxia responsive element,HRE)途徑。HIF-1是在低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異性轉(zhuǎn)錄因子,由低氧敏感的α亞單位和結(jié)構(gòu)性的β亞單位組成的異二聚體。HIF-1α在低氧條件下進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與β亞單位組成穩(wěn)定的HIF-1異二聚體,與HRE結(jié)合并啟

2、動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α的基因敲除小鼠腎臟纖維化加重,提示HIF-1α是一個(gè)新的調(diào)節(jié)腎臟纖維化的因子。
　　 傳統(tǒng)上認(rèn)為蛋白尿是慢性腎臟病(Chronic Kideny Disease,CKD)進(jìn)展的最重要危險(xiǎn)因素之一,與CKD患者的生存率及腎存活率都有明確的相關(guān)性。持續(xù)蛋白尿可導(dǎo)致嚴(yán)重的小管間質(zhì)損害及腎臟疾病的進(jìn)展,做為蛋白尿的主要成分--白蛋白對(duì)小管間質(zhì)損害起到?jīng)Q定性作用。腎小球疾病導(dǎo)致尿中增加

3、的白蛋白在腎小管重吸收和分解的過程中消耗大量能量,而由于腎臟本身結(jié)構(gòu)的因素,腎小管所在區(qū)域的氧分壓又比較低,故臨床上低氧張力常同白蛋白過負(fù)荷同時(shí)存在,因此很自然考慮到白蛋白過負(fù)荷與低氧張力在促進(jìn)腎臟纖維化方面是否存在某些聯(lián)系。事實(shí)上,HIF-1的很多下游基因在白蛋白過負(fù)荷誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用,如CTGF和TIMP-1等。自蛋白誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)CTGF和TIMP-1,進(jìn)而促進(jìn)膠原蛋白的合成,并抑制膠原蛋白的降解。<

4、br>　　 基于以上背景,本研究假設(shè)白蛋白通過HIF/HRE途徑啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮致腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用,設(shè)計(jì)如下:首先在構(gòu)建HRE-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,檢測無脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞系(NRK-52E)HIF/HRE轉(zhuǎn)錄活性的影響；然后觀察BSA對(duì)NRK-52E細(xì)胞凋亡、前纖維化因子的合成和轉(zhuǎn)分化三個(gè)方面的影響,并應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默HIF-1α,深入探討HIF-1α在其中的作用。
　　

5、 第一部分研究BSA過負(fù)荷對(duì)腎小管上皮細(xì)胞HIF/HRE轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　 目的應(yīng)用HRE報(bào)告基因質(zhì)粒檢測不同濃度白蛋白孵育不同時(shí)間對(duì)NRK-52E細(xì)胞HIF/HRE轉(zhuǎn)錄活性的影響。方法pGL3-Epo-HRE-uc報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NRK-52E細(xì)胞在含BSA(0,5,10及20mg/ml)的培養(yǎng)基中孵育24h,48h及72h,雙熒光素酶法檢測各組的相對(duì)熒光強(qiáng)度,Western Blotting法檢測相應(yīng)條件下HIF-1α

6、的表達(dá)。結(jié)果小劑量(5mg/ml)BSA孵育24h就能夠增加NRK-52E細(xì)胞的HIF/HRE轉(zhuǎn)錄活性,并且HIF/HRE轉(zhuǎn)錄活性隨BSA劑量增加和刺激時(shí)間延長而增強(qiáng)。BSA(20mg/ml)呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)NRK-52E細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)。小結(jié)表明BSA增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞HIF/HRE轉(zhuǎn)錄活性。
　　 第部分研究shRNAHIF-1α轉(zhuǎn)染對(duì)BSA過負(fù)荷致腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響
　　 實(shí)驗(yàn)一 shRNAHIF-1

7、α轉(zhuǎn)染對(duì)BSA過負(fù)荷致腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的探討B(tài)SA過負(fù)荷對(duì)NRK-52E細(xì)胞凋亡的影響及HIF-1α在其中的作用。
　　 方法 NRK-52E細(xì)胞在含不同濃度BSA的培養(yǎng)基中孵育不同時(shí)間的凋亡情況應(yīng)用TUNEL和AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測,同時(shí)應(yīng)用WesternBlotting方法檢測Bax蛋白表達(dá)。然后觀察應(yīng)用shRNA沉默HIF-1α對(duì)NRK-52E細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果抗

8、BSA抗體與dUTP雙染細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測到NRK-52E細(xì)胞在含BSA20mg/ml的培養(yǎng)基中發(fā)生凋亡細(xì)胞的位置與攝取BSA細(xì)胞的位置一致；流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測到低濃度BSA(Smg/ml)對(duì)NRK-52E細(xì)胞凋亡影響較小,而高濃度(>10mg/ml)長時(shí)間(>48h)刺激則顯著加重凋亡；WesternBlotting方法檢測NRK-52E細(xì)胞在BSA(20mg/ml,72h)刺激下總Bax蛋白表達(dá)無顯著改變,而6A7單克隆抗體檢測到

9、的活化Bax蛋白表達(dá)顯著增高。shRNA-Hiflα轉(zhuǎn)染細(xì)胞在BSA(20mg/ml,72h)刺激下的凋亡率和活化Ba)[蛋白表達(dá)顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。小結(jié)BSA誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞凋亡需要較大濃度和較長刺激時(shí)間,HIF/HRE轉(zhuǎn)錄活性增加參與了較大劑量BSA誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡。
　　 實(shí)驗(yàn)二shRNAHIF-1α轉(zhuǎn)染對(duì)BSA過負(fù)荷致腎小管上皮細(xì)胞前纖維化因子表達(dá)的影響
　　 目的探討巨噬細(xì)胞趨化因子-1

10、(MCP-1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)和組織型金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)等前纖維化因子在BSA誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)中的作用,及HIF-1α在其中的作用。方法NRK-52E細(xì)胞在含不同濃度BSA的培養(yǎng)基中孵育不同時(shí)間,層粘連蛋白(FN)、MCP-1、CTGF和TIMP-1的表達(dá)應(yīng)用Western Blotting、RT-PCR和ELISA等方法檢測。結(jié)果較低濃度BSA(5mg/ml)在較短的刺激時(shí)間(2

11、4h)即誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞MCP-1蛋白高表達(dá),BSA濃度愈高、刺激時(shí)間愈長,MCP-1表達(dá)愈高；在BSA10mg/ml刺激72h時(shí),NRK-52E細(xì)胞FN,CTGF和TIMP-1的表達(dá)顯著高于BSA(0mg/ml)組。shRNA-Hiflα轉(zhuǎn)染細(xì)胞在BsA(10mg/ml,72h)刺激下FN,MCP-1,CTGF和TIMP-1的表達(dá)顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。小結(jié)BSA呈劑量和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞前纖維化因子和細(xì)胞外基質(zhì)

12、蛋白的表達(dá),并且這種作用部分通過HIF/HRE途徑實(shí)現(xiàn)。
　　 實(shí)驗(yàn)三shRNAHIF-1α轉(zhuǎn)染對(duì)BSA過負(fù)荷致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響目的探討B(tài)SA對(duì)NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響,及HIF-1α在其中的作用。方法NRK-52E細(xì)胞在含不同濃度BSA的培養(yǎng)基中孵育不同時(shí)間,細(xì)胞間緊密連接(ZO-1)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的表達(dá)應(yīng)用Western Blotting、RT-PCR和EL

13、ISA等方法檢測。結(jié)果在BSA10mg/ml刺激72h時(shí),NRK-52E細(xì)胞ZO-1表達(dá)顯著高于BSA(0mg/ml)組,而α-SMA則顯著高于BSA(0mg/m1)組,shRNA-Hiflα轉(zhuǎn)染部分逆轉(zhuǎn)BSA的作用。在BSA10mg/ml刺激24h,48h和72h時(shí),NRK-52E細(xì)胞TGF-β1蛋白含量都顯著高于BSA(0mg/ml)組,shRNA-Hiflα轉(zhuǎn)染細(xì)胞TGF-β1蛋白含量則顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組。小結(jié)較小劑量的BS