人血白蛋白制劑中蛋白組分的研究.pdf

1、人血白蛋白(Human serum albumin，HSA)是由健康人的血漿經(jīng)低溫乙醇分離提取并經(jīng)病毒滅活后制成的生物制品，臨床上用于出血性、外傷性體克、燒傷、肝硬化伴腹水和水腫、惡性腫瘤、腎病水腫等。
　　目前國內(nèi)企業(yè)采用低溫乙醇法壓濾工藝分離血漿蛋白，該工藝具有蛋白收率高，生產(chǎn)成本低，經(jīng)濟效益好，因而在工業(yè)化生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。然而低溫乙醇法特異性不高，在生產(chǎn)的過程中不能完全除去雜蛋白成分，各企業(yè)的工藝參數(shù)也不盡相同，因此在終產(chǎn)

2、品中會存在一定量的雜蛋白。據(jù)文獻表明，制劑中存在的這些雜蛋白是引起的臨床不良反應(yīng)的主要原因之一[1]，不良反應(yīng)類型主要為全身過敏反應(yīng)和多器官損壞，包括過敏性休克、熱原樣反應(yīng)、腎臟損害等。因此探究血液制品中的未知蛋白可為臨床不良反應(yīng)提供參考，本課題旨在建立雜蛋白分離分析的方法并測定人血白蛋白制劑中的雜蛋白的組成，為各企業(yè)的生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供了數(shù)據(jù)支持，同時為產(chǎn)品的一致性評價奠定基礎(chǔ)。
　　為了初步了解各企業(yè)的雜蛋白含量和種類的差異，對

3、五家企業(yè)近兩年的批簽發(fā)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，共獲得323批白蛋白制劑的純度數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，五家企業(yè)生產(chǎn)的白蛋白制劑純度范圍在96.2％～98.3%之間，企業(yè)間差異較大。其中A企業(yè)生產(chǎn)的制劑純度較為均一，提示生產(chǎn)工藝較為穩(wěn)定；B企業(yè)生產(chǎn)的制劑純度較其他四所企業(yè)低，顯示產(chǎn)品中存在一定量的未知蛋白。為了進一步分析各企業(yè)制劑的蛋白組成異同，對白蛋白制劑進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，初步探究其組成成分的異同，結(jié)果顯示各企業(yè)間生產(chǎn)的白

4、蛋白制劑差異較小，各企業(yè)制劑的雜蛋白有8~9條帶。鑒于醋酸纖維素薄膜電泳與SDS-PAGE方法的局限性，不能特異性地鑒定出雜蛋白成分，本研究嘗試建立未知蛋白譜鑒定方法，進而確定各企業(yè)生產(chǎn)的人血白蛋白制劑的未知蛋白組成。
　　在建立質(zhì)譜分析方法時，首先對供試品濃度進行選擇，再對質(zhì)譜鑒定參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，白蛋白濃度超過5mg/ml時，超過儀器鑒定閾值，導致白蛋白主成分未能被成功鑒定，提示蛋白濃度不能過高。蛋白濃度在1mg/ml-

5、2mg/ml時，主成分白蛋白肽圖較為完整，但未知蛋白檢出效率低；對白蛋白肽圖中的肽段進行b/y離子連續(xù)性分析發(fā)現(xiàn)，蛋白鑒定得分大于150分，結(jié)果具有較高的可信度。以上結(jié)果提示主成分蛋白濃度過高，掩蓋未知蛋白的的信號，未知蛋白的鑒定需要對未知蛋白進一步分離。
　　結(jié)合前期結(jié)果，對各企業(yè)的白蛋白中未知成分進行分離純化、酶切方法的優(yōu)化，確立其分離純化方法，并分析各企業(yè)未知蛋白的種類、數(shù)量、分子量、等電點分布及其工藝相關(guān)性。采用陰離子交換

6、柱與凝膠過濾層析柱分別對白蛋白進行分離，結(jié)果顯示,使用陰離子交換層析只能得到主成分單一峰，而使用凝膠過濾層析得三組峰，因此采用凝膠過濾層析對白蛋白中位置組分進行分離。采用胃蛋白酶和胰蛋白酶分別對各分離組分進行酶切,結(jié)果顯示,胃蛋白酶酶切結(jié)果重復性較差且蛋白得分較低，而使用胰蛋白酶重現(xiàn)性良好，蛋白鑒定得分較高。對胰蛋白酶酶切效果進行進一步確證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),三次平行實驗,共有11個蛋白被檢出,其中共有8個蛋白每次均檢出,說明方法穩(wěn)定性較好。最

7、終采用胰蛋白酶對人血白蛋白中的未知蛋白成分進行鑒定,結(jié)果顯示五家生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品,除一家企業(yè)雜蛋白較少外，另外四家企業(yè)所有批次樣品均含有載脂蛋白A-Ⅱ（Apolipoprotein A-II）、人結(jié)合珠蛋白（Haptoglobin）、人血色素結(jié)合蛋白（Hempoexin）、α-1B-糖蛋白（Alpha-1B-glycoprotein）、α-2-HS-糖蛋白（Alpha-2HS-glycoprotein），且略有差異。對未知蛋白等電點進行分析

8、發(fā)現(xiàn)，未知蛋白等電點與白蛋白較接近，可能在乙醇共沉淀時與白蛋白共同析出，初步可以說明未知蛋白為工藝相關(guān)蛋白；對未知蛋白分子量進行分析發(fā)現(xiàn)，未知蛋白以多聚體的形式存在于白蛋白中。
　　以上結(jié)果表明，在臨床應(yīng)用中，應(yīng)更加關(guān)注上述未知蛋白的過敏效應(yīng)，在工業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)優(yōu)化生產(chǎn)工藝，盡可能去除無關(guān)蛋白，提高產(chǎn)品質(zhì)量。本課題建立的白蛋白制劑雜蛋白質(zhì)譜分析方法為探究臨床不良反應(yīng)提供了數(shù)據(jù)支持，為白蛋白制劑的一致性評價提供了新的方法，為血液制品的