名貴中藥冬蟲夏草品種及蛋白組分研究.pdf

1、冬蟲夏草是一味來源獨(dú)特、療效顯著的名貴中藥，在我國具有悠久的藥用歷史，具有“補(bǔ)腎益肺、止血化痰”的功效，主要用于治療久咳虛喘、陽痿遺精、勞嗽咯血、腰膝酸軟等肺腎疾病。自18世紀(jì)（1785年），英國真菌學(xué)家Dickson首次將其帶回西方，冬蟲夏草這味神奇的中藥從此走出國門，走向世界，也打開了冬蟲夏草現(xiàn)代研究的大門?，F(xiàn)代藥學(xué)研究證明，冬蟲夏草富含多種化學(xué)成分，其補(bǔ)益作用主要表現(xiàn)在對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)方面有著獨(dú)特療效。
　　隨著人們對亞健康越

2、來越重視，冬蟲夏草這味性味溫和的天然補(bǔ)益藥市場需求日益增大，而其年產(chǎn)量有限，人工培育等替代品研究尚不成熟。其價(jià)格昂貴，逐年升高，市場出現(xiàn)了大量的摻偽品、混淆品，并且流通渠道較為混亂、不規(guī)范。而《中國藥典》對冬蟲夏草品種定義存在值得商榷的地方，對其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)僅以在蟲生真菌內(nèi)廣泛存在的腺苷作為指標(biāo)性成分，難以有效地、有針對性的鑒別真?zhèn)尾⑦M(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。蛋白類成分是冬蟲夏草化學(xué)成分的重要組成部分，蛋白質(zhì)本身就是品種遺傳信息在細(xì)胞水平的表達(dá)，并

3、且通常具有良好的生物活性，蛋白組學(xué)是目前國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，特別是其在差異性蛋白表達(dá)、功能性蛋白篩選方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，而一直以來對冬蟲夏草蛋白成分的研究較為滯后，相關(guān)報(bào)道極少。鑒于此，本課題對冬蟲夏草開展了以下幾方面的研究工作：
　　1、正品冬蟲夏草品種研究
　　通過對冬蟲夏草菌體、蟲體的基原品種考證，闡述了冬蟲夏草菌的分類學(xué)研究進(jìn)展。根據(jù)分子系統(tǒng)學(xué)研究最新進(jìn)展，在2007年，冬蟲夏草的有性型及全型已歸類為子囊菌綱、線形蟲草科

4、、線性蟲草屬Ophiocordyceps sinensis(Berk.) G. H. Sung, J.M.Sung, Hywel-Jones&Spatafora.，簡寫為Ophiocordyceps sinensis(Berk.) G. H. Sung et al.，建議藥典對菌的基原物種進(jìn)行更新。通過對冬蟲夏草蟲體基原品種考證發(fā)現(xiàn)，目前冬蟲夏草蟲體品種為59種，大多數(shù)學(xué)者公認(rèn)冬蟲夏草菌的寄主昆蟲集中在Hepialidae蝠蛾屬Hepi

5、alus里。
　　首次對中藥冬蟲夏草的命名進(jìn)行系統(tǒng)的研究，對歷版中國藥典及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析，表明“冬蟲夏草”作為藥材中文名比較客觀、合適，但專屬性不強(qiáng)；中藥冬蟲夏草應(yīng)與冬蟲夏草菌區(qū)別，其藥材的拉丁名不應(yīng)直接等同于冬蟲夏草菌的屬名，建議結(jié)合蟲體部位與冬蟲夏草菌最新學(xué)名進(jìn)行藥材命名：Ophiocordyceps Hepialus。
　　2、冬蟲夏草蛋白質(zhì)2-DE方法優(yōu)化與特征性蛋白的鑒定
　　在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，本論

6、文進(jìn)一步對適用于冬蟲夏草蛋白2-DE方法進(jìn)行考察，得到了最佳方法條件：（1）上樣量600μg（2）被動水化方式（3）搭建鹽橋進(jìn)行深度除鹽；重現(xiàn)性研究結(jié)果顯示該方法對同一產(chǎn)地同一批次樣品的匹配率達(dá)到89.5％，表明該方法穩(wěn)定可靠。首次對冬蟲夏草2-DE過程中蛋白含量測定方法進(jìn)行研究，確定了 Bradford法是作為冬蟲夏草可溶性蛋白檢測的最適方法。
　　通過研究了不同產(chǎn)地冬蟲夏草蛋白表達(dá)圖譜的差異性、共同性，找出了特征性蛋白點(diǎn)12個(gè)

7、，并對其中的5個(gè)進(jìn)行了初步的結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果為：乙酰乳酸合成酶小亞基類、轉(zhuǎn)錄修復(fù)偶聯(lián)因子類、假設(shè)蛋白Mnod_7043類、FMN依賴的α-羥基酸脫氫酶類、鐵硫氧化還原酶類蛋白類。
　　首次對不同產(chǎn)地冬蟲夏草進(jìn)行多樣性分析（差異性蛋白、共有蛋白），結(jié)果表明不同產(chǎn)地正品冬蟲夏草蛋白種類差異較大，結(jié)合前面品種研究，認(rèn)為冬蟲夏草蛋白的多樣性與不同產(chǎn)地優(yōu)勢冬蟲夏草菌寄主昆蟲的種類有關(guān)。這為后續(xù)通過冬蟲夏草特征性蛋白的對不同冬蟲夏草產(chǎn)地

8、溯源奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)提出通過尋找不同來源正品中藥的共有蛋白來建立合適的特征性蛋白質(zhì)表，對多基原中藥以及復(fù)合物中藥質(zhì)量評價(jià)研究提供一條參考思路。
　　3、首次對冬蟲夏草中免疫活性蛋白進(jìn)行研究
　　利用酶聯(lián)免疫法測定藥物對巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1、IL-12因子的影響，對冬蟲夏草蛋白組分的免疫活性進(jìn)行研究，優(yōu)化了體外免疫活性檢測的方法：分離得到小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)3 h細(xì)胞貼壁后給藥， LPS（作為后期實(shí)驗(yàn)的陽性對照）

9、給藥終濃度為10μg2ml-1，給藥9 h后終止反應(yīng)，棄掉營養(yǎng)培養(yǎng)基，更換雙無培養(yǎng)基，細(xì)胞分泌36 h后離心，取出上清液即得分別含有TNF-α、IL-1、IL-12因子的待測樣品。試驗(yàn)應(yīng)在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取純化后72 h內(nèi)完成。
　　首次對冬蟲夏草蛋白組分的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，篩選出適合的蛋白組分保存條件：緩沖液PB（pH=7.2，0.45mmol2L-1 DTT）作為冬蟲夏草蛋白保存液，保存溫度為-20℃，保存時(shí)間10 d。

10、r>　　首次通過結(jié)合免疫活性跟蹤，對冬蟲夏草蛋白進(jìn)行超濾分離，得到4個(gè)分子量段，超濾效果較好。免疫活性檢測結(jié)果表明，冬蟲夏草蛋白總提物以及各分子量段蛋白組分對巨噬細(xì)胞免疫系統(tǒng)總體表現(xiàn)出多方面的雙向調(diào)節(jié)，包括:（1）功能性的雙向調(diào)節(jié)，即不同分子量段對正常巨噬細(xì)胞具有一定促進(jìn)、抑制作用或作用不明顯；對免疫狀態(tài)低下的細(xì)胞（β-巰基乙醇造模損傷），能顯著的促進(jìn)免疫因子的分泌接近正常水平或具有免疫促進(jìn)作用的的趨勢；對免疫狀態(tài)過度旺盛的細(xì)胞（LPS

11、刺激），能顯著的抑制免疫因子的分泌接近正常水平或具有免疫抑制作用的趨勢；（2）劑量性雙向調(diào)節(jié)，不同分子量段蛋白樣品對免疫因子的調(diào)節(jié)，沒有呈顯著的線性關(guān)系，但總體上、在一定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)為高濃度促進(jìn)免疫、低濃度抑制免疫的雙向調(diào)節(jié)作用;（3）不同分子量趨勢性雙向調(diào)節(jié)，雖然不同分子量段蛋白組分對不同免疫因子表現(xiàn)為不同的免疫調(diào)節(jié)作用，總體上分析發(fā)現(xiàn)，大分子量蛋白組分主要表現(xiàn)為免疫促進(jìn)作用，隨著分子量的降低，免疫抑制作用越明顯。
　　通過凝