混合模式層析和擴(kuò)張床吸附分離重組人血白蛋白研究.pdf

1、人血白蛋白(HSA)是人體血漿中最重要的蛋白質(zhì)之一，廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，市場(chǎng)需求巨大。人血漿來源HSA(pHSA)受限于血漿，以及病毒污染等風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致貨源緊張。基因重組人血白蛋白(rHSA)能避免病毒感染，解決原料緊張等問題，不過分離純化要求高。常規(guī)rHSA分離中常用陽離子交換層析捕獲rHSA，料液需要稀釋和pH調(diào)節(jié)，影響分離效率，研發(fā)具有高選擇性和耐鹽特性的新型分離方法將有助于改善rHSA分離工藝?；旌夏Ｊ綄游?MMC)和擴(kuò)張床吸附(

2、EBA)是兩種新型的生物分離方法，MMC具有吸附量大、選擇性高、耐鹽性好、洗脫條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，EBA可直接從含有生物質(zhì)固體顆粒的料液中捕獲目的蛋白。本文從新型配基篩選和介質(zhì)制備出發(fā)，探討MMC和EBA分離rHSA新過程，發(fā)揮MMC高效分離和EBA高處理量的優(yōu)勢(shì)，形成混合模式擴(kuò)張床吸附新方法，實(shí)現(xiàn)酵母發(fā)酵液中分離rHSA。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　(1)基于色氨酸類似物的混合模式配基篩選。依據(jù)HSA可結(jié)合色氨酸的特點(diǎn)，篩選色氨酸及其類

3、似物作為配基，制備了10種混合模式介質(zhì)，比較了HSA吸附性能。發(fā)現(xiàn)HSA吸附受pH影響顯著，最高吸附容量出現(xiàn)在HSA等電點(diǎn)附近，以色胺為配基的TA-B介質(zhì)飽和吸附容量最高，達(dá)143.54 mg/ml。酸性條件下，飽和吸附容量和結(jié)合常數(shù)下降明顯。添加鹽后，HSA吸附容量下降，不過TA-B介質(zhì)在高鹽下仍有較高的吸附容量（約95 mg/ml）。結(jié)果表明，以色胺為配基的TA-B介質(zhì)對(duì)HSA具有較強(qiáng)的親和力，良好的耐鹽特性，且在較寬的pH范圍內(nèi)具

4、有較高的吸附容量。
　　(2)以色胺為配基的混合模式介質(zhì)制備及吸附性能。以色胺為功能配基，3種瓊脂糖微球?yàn)榛|(zhì)，優(yōu)化基質(zhì)活化和配基偶聯(lián)過程，制備了系列配基密度的色胺介質(zhì)。pHSA靜態(tài)吸附結(jié)果顯示，配基密度影響蛋白吸附，合適的基質(zhì)和中等配基密度可以得到較理想的吸附容量。相比于商業(yè)化混合模式介質(zhì)，TA-B-6FF對(duì)HSA的吸附容量更高。吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，pH5.0時(shí)吸附速率最快，有效孔擴(kuò)散系數(shù)最高，添加鹽會(huì)減緩蛋白在介質(zhì)內(nèi)的擴(kuò)散速率

5、。蛋白穿透實(shí)驗(yàn)表明，TA-B-6FF介質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)合能力較強(qiáng)，流速對(duì)動(dòng)態(tài)載量影響較小，在700 cm/h高流速仍具有較高的動(dòng)態(tài)載量(54.5 mg/ml)，適合用于高流速操作。
　　(3)混合模式層析分離重組人血白蛋白。以畢赤酵母發(fā)酵液為原料，考察了TA-B-6FF層析分離rHSA。 rHSA靜態(tài)吸附規(guī)律與pHSA類似，pH5.0時(shí)吸附最佳，Qm為54.60 mg/ml;在pH6.0～8.0范圍內(nèi)，變化較小;pH4.0時(shí)，吸附容量顯

6、著下降。料液稀釋對(duì)rHSA吸附影響不大，發(fā)酵液可不經(jīng)過稀釋和pH調(diào)節(jié)直接上樣。動(dòng)態(tài)載量隨流速增加而逐漸降低，流速為100～300 cm/h時(shí)，Q10％為19.7～30.3 mg/ml介質(zhì)，上樣量約2.0～3.5 ml發(fā)酵液/ml介質(zhì)。優(yōu)化分離工藝，采用兩步洗脫，rHSA單體收率為98.5％，純度為87.8％，純化因子約11，色素和HCP去除率約90％。經(jīng)20次層析分離驗(yàn)證，過程穩(wěn)定性良好。
　　(4)混合模式擴(kuò)張床吸附分離重組人血

7、白蛋白。以石英砂/瓊脂糖和碳化鎢/瓊脂糖復(fù)合多孔微球?yàn)榛|(zhì)，色胺為配基，制備了混合模式擴(kuò)張床介質(zhì)TA-S和TA-T。靜態(tài)吸附結(jié)果表明，pH5.0時(shí)HSA吸附最佳，TA-S和TA-T飽和吸附容量分別為164.18 mg/ml和72.06 mg/ml，且具有一定的耐鹽吸附特性。固定床模式下，流速對(duì)蛋白吸附的影響較大;擴(kuò)張床模式下，膨脹率越大，蛋白穿透越快，動(dòng)態(tài)載量逐漸下降，最佳膨脹率為1.8，TA-S和TA-T的動(dòng)態(tài)載量分別為27.54mg

8、/ml和18.04 mg/ml介質(zhì)。酵母發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH5.0后直接上樣，采用兩步洗脫，TA-S介質(zhì)擴(kuò)張床吸附分離效果較好，rHSA單體收率和純度分別為91.6％和83.3％。
　　(5) HSA與色胺介質(zhì)的相互作用分析。采用分子模擬，通過分子對(duì)接確定HSA表面有4個(gè)潛在的色胺結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)位于典型的吲哚結(jié)合位點(diǎn)。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示，色胺配基與HSA結(jié)合穩(wěn)定，結(jié)合位點(diǎn)周圍以疏水氨基酸殘基為主，但部分負(fù)電或極性殘基貢獻(xiàn)更大的靜

9、電作用能，說明色胺-HSA結(jié)合以靜電作用為主，氫鍵和疏水作用為輔。等溫滴定量熱分析表明，pH4.0～7.0時(shí)，色胺介質(zhì)主要通過靜電作用吸附HSA，pH8.0時(shí)HSA結(jié)合以疏水作用為主;隨NaCl濃度增大，色胺-HSA相互作用由靜電為主轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷饔脼橹鳌?br>　　本文圍繞rHSA分離，集中于MMC和EBA兩種新型生物分離方法，從配基篩選、介質(zhì)制備和吸附性能出發(fā)，通過分離過程優(yōu)化實(shí)現(xiàn)酵母發(fā)酵液中高效分離rHSA，形成混合模式層析和擴(kuò)張床