熱休克蛋白72抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化的影響.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑。其主要病理變化是腎小管上皮細(xì)胞丟失、腎小管萎縮，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)增多及間質(zhì)中出現(xiàn)大量肌成纖維細(xì)胞。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，腎小管上皮細(xì)胞凋亡對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的丟失導(dǎo)致腎臟萎縮及疾病的進(jìn)展起著重要作用。但腎小管上皮細(xì)胞凋亡對(duì)腎間質(zhì)纖維化的影響尚無(wú)直接證據(jù)。熱休克蛋白72(HSP72)是一種高度保守的內(nèi)源性、細(xì)胞保護(hù)性蛋白，在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)發(fā)揮分子伴侶作用。近年來(lái)HSP7

2、2的抗凋亡作用廣泛受到關(guān)注。單側(cè)輸尿管梗阻模型(UUO)是經(jīng)典的腎小管間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型。已有研究證實(shí)，UUO模型中HSP72僅在梗阻側(cè)腎表達(dá)增高，提示其增高為組織損傷后的一種特異性反應(yīng)，然而內(nèi)源性的HSP72不足以起到組織損傷時(shí)的細(xì)胞保護(hù)作用。外源性HSP72是否能在腎小管間質(zhì)損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，目前國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。本研究擬(1)通過(guò)施維舒(geranylgeranylacetone，GGA)誘導(dǎo)大鼠特異性高表達(dá)HSP72，探討HSP

3、72對(duì)大鼠UUO模型腎小管間質(zhì)纖維化的影響；(2)通過(guò)含HSP72基因的腺病毒感染腎小管上皮細(xì)胞株，明確腎小管上皮細(xì)胞凋亡與轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)的關(guān)系并探討HSP72對(duì)轉(zhuǎn)分化的影響，從而為腎小管間質(zhì)纖維化的防治提供新的思路和理論依據(jù)。 第一章HSP72對(duì)大鼠UUO模型腎小管間質(zhì)纖維化的影響 目的：探討大鼠UUO模型中HSP72對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡及腎小管間質(zhì)纖

4、維化的影響。 方法：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組、模型組和GGA處理組。建立模型前1d開始，GGA處理組和模型組分別給予400mg/kgGGA和溶媒(0.05％阿拉伯樹膠+0.008％維生素E)灌胃，每天1次，在模型建立后第3d，7d和14d分別處死大鼠(n=5)。常規(guī)染色觀察腎臟組織病理改變，間接免疫熒光及western-blot檢測(cè)細(xì)胞緊密連接E-cadherin及肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-

5、SMA；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)促凋亡蛋白Bax及增殖細(xì)胞核抗原PCNA的表達(dá)；TUNEL染色檢測(cè)腎小管上皮凋亡細(xì)胞數(shù)；western-blot檢測(cè)HSP72及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。 結(jié)果：UUO模型組第3d、7d和14d腎小管損害的百分比分別為38.6±0.04、65.8±0.07、81.9±0.04，顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)；腎間質(zhì)纖維化分值3d、7d和14d分別為0.38±0.15、1.36±0.59、2.87±

6、0.69，顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，提示大鼠UUO模型的成功建立。免疫組化染色顯示促凋亡蛋白Bax主要位于病變的腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，與假手術(shù)組相比，Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2下調(diào)，說(shuō)明大鼠UUO模型中，凋亡信號(hào)通路被激活。Western-blot結(jié)果顯示，GGA組HSP72表達(dá)明顯上調(diào)。GGA干預(yù)后7d組腎間質(zhì)纖維化分值顯著降低(P＜0.05)，為0.4±0.25。腎小管上皮TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(2.81±0.45)及P

7、CNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(17.66±4.51)，與對(duì)照組凋亡細(xì)胞數(shù)(6.78±1.21)及增殖細(xì)胞數(shù)(113.7±6.36)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。GGA干預(yù)后抗凋亡蛋白Bcl-2及上皮細(xì)胞連接E-cadherin恢復(fù)，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)下調(diào)。但是，GGA3d及14d組未觀察到HSP72改善腎小管上皮凋亡及腎小管間質(zhì)纖維化的效應(yīng)。 小結(jié)：UUO大鼠模型中腎小管上皮細(xì)胞凋亡及腎小管間質(zhì)纖維化程度隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)

8、而加重。UUO7d時(shí)，HSP72可改善腎小管上皮細(xì)胞的凋亡及腎小管間質(zhì)纖維化。 第二章上調(diào)表達(dá)HSP72抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡對(duì)EMT的影響 目的：明確腎小管上皮細(xì)胞凋亡與EMT的關(guān)系，并探討上調(diào)表達(dá)HSP72抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡對(duì)EMT的影響。 方法：NRK-52E細(xì)胞分成A：無(wú)血清對(duì)照組；B：TGF-β1刺激組；C：pan-caspase抑制劑+TGF-β1組；D：腺病毒感染細(xì)胞高表達(dá)HSP72+TGF-β

9、1組，其中B組分不同濃度組(0.5、1、2.5、5、10、20ng/ml)和不同時(shí)間點(diǎn)組(6、12、24、48、72h)。C組pan-caspase抑制劑分不同濃度組(25、50、100、150μM)。熒光顯微鏡觀察腺病毒感染細(xì)胞的效率；相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，間接免疫熒光及Western-blot檢測(cè)EMT標(biāo)志物E-cadherin及α-SMA的變化；TUNEL及AnnexinV-FITC+PI雙染觀察細(xì)胞凋亡的變化，Weste

10、rn-blot檢測(cè)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、pro-caspase3的變化。 結(jié)果：TGF-β1呈劑量及時(shí)間依賴性同時(shí)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT及凋亡。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，不同濃度pan-caspase抑制劑組(25，50，100，150μM)凋亡發(fā)生率分別為(15.9±1.7)％、(21.1±7.8)％、(16.3±3.7)％、(17.4±4.6)％，與TGF-β1+DMSO組相比(36.6±11.3)％，有顯著性差異(P＜0.

11、05)。與TGF-β1刺激組相比，western-blot結(jié)果可見不同濃度pan-caspase抑制劑組(50，100，150μM)E-cadherin均有不同程度回升(P＜0.05)；但不同濃度pan-caspase抑制組組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。pan-caspase抑制劑處理后，α-SMA的表達(dá)未見明顯減弱，提示pan-caspase抑制劑不能改善腎小管上皮細(xì)胞EMT。含HSP72RNA的腺病毒感染腎小管上皮細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可見GFP

12、熒光陽(yáng)性率高達(dá)90％以上。Western-blot結(jié)果腺病毒感染組HSP72顯著增高，比對(duì)照組高3.41倍。與空載體組、pan-caspase抑制劑組相比，上調(diào)表達(dá)HSP72的腎小管上皮細(xì)胞，其α-SMA的蛋白水平明顯降低(P＜0.001)。 小結(jié)：Pan-caspase抑制劑預(yù)處理不能逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞EMT。上調(diào)表達(dá)HSP72可以明顯逆轉(zhuǎn)EMT，該效應(yīng)可能不依賴于其抗腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用。 結(jié)論1.上調(diào)表達(dá)HSP