白三烯自分泌-旁分泌環(huán)路在大鼠急性肝損傷模型中表達(dá)特征及積雪草酸的調(diào)控.pdf

1、1白三烯合成酶系在大鼠急性肝損傷模型中表達(dá)特征 目的： 探索白三烯合成相關(guān)酶系在D－GalN/LPS或CC14誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型中表達(dá)和活性變化，為揭示急性肝損傷發(fā)生發(fā)展病理基礎(chǔ)提供相關(guān)依據(jù)。 方法： 大鼠經(jīng)腹腔注射D-GalN/LPS1，3，6，12h誘導(dǎo)肝臟急性損傷模型，并與經(jīng)D-GalN/LPS所致體外損傷原代培養(yǎng)肝細(xì)胞模型比較；或注射CC143，6，12，24h誘導(dǎo)肝臟損傷模型。用酶聯(lián)免疫分析法

2、測定cys-LT量；用HPLC檢測LTC4合成酶系酶活力；RT-PCR測定LTC4S和mGST2mRNA表達(dá)；Westernblot檢測LTC4S蛋白表達(dá)；免疫組化定位測定LTC4S和mGST2蛋白表達(dá)。體外建立肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞共培養(yǎng)體系，D-GalN/LPS損傷以模擬整體大鼠急性肝損傷模型。 結(jié)果： D-GalN/LPS處理6，12h出現(xiàn)顯著的大鼠肝臟損傷，但在處理1，3h時(shí)，即伴有cys-LT含量急劇增加，提示cy

3、s-LT聚集極有可能與肝損傷相關(guān)。D-GalN/LPS處理1h起，白三烯合成酶系表達(dá)呈上調(diào)趨勢，伴有酶活力顯著增強(qiáng)。D-GalN/LPS處理原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中cys-LT含量極低且無顯著變化；LTC4S和mGST2基因表達(dá)和酶活力也無顯著變化。原代大鼠肝細(xì)胞和枯否細(xì)胞共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷，結(jié)果與整體實(shí)驗(yàn)相吻，提示可較好地模擬整體肝臟損傷模型。 結(jié)論： 大鼠D-GalN/LPS急性肝損傷模型中，炎癥因子cys-

4、LT聚集與肝損傷相關(guān)；Cys-LT。聚集與白三烯合成酶系的表達(dá)上調(diào)和酶活力增強(qiáng)相關(guān)；大鼠D-GalN/LPS急性肝損傷中cys-LT及其合成酶系表達(dá)增加需要肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞參與；肝細(xì)胞和枯否細(xì)胞共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷模型，可替代整體模型用于研究LTC4合成酶系在肝臟中作用。 2白三烯受體在大鼠肝組織中定位及在D-GalN/LPS急性肝損傷中表達(dá)變化 目的： 探索大鼠肝組織中cysLT1R表達(dá)及定位，在D-

5、GalN/LPS急性肝損傷過程中cysLT1R表達(dá)變化。 方法： 采用RT-PCR、Westernblot和免疫組化法檢測cysLT1R在大鼠肝臟及肝細(xì)胞中表達(dá)；采用工具藥觀察肝細(xì)胞中表達(dá)情況，即用LTD4刺激后，檢測細(xì)胞內(nèi)鈣變化，并觀察特異性受體拮抗劑ONO-1078處理對內(nèi)鈣變化的影響。構(gòu)建大鼠D-GalN/LPS急性肝損傷模型，檢測cysLT1R的表達(dá)變化。 結(jié)果： RT-PCR和Westernbl

6、ot檢測均表明大鼠肝臟及肝細(xì)胞中有mRNA和蛋白表達(dá)；免疫組化法檢測表明cysLT1R分布于內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的細(xì)胞膜上。采用工具藥觀察結(jié)果也表明肝細(xì)胞中存在cysLT1R表達(dá)。大鼠D－GalN/LPS處理6、12h后肝臟cysLT1R表達(dá)增加。 結(jié)論： 大鼠肝臟內(nèi)皮細(xì)胞及肝細(xì)胞中表達(dá)cysLT1R，且在D-GalN/LPS處理后期存在表達(dá)增加。 3積雪草酸對大鼠原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)體系損傷保護(hù)作用及對白三烯環(huán)路相關(guān)的

7、調(diào)控機(jī)制研究 目的： 探索Redox信號通路對大鼠原代肝細(xì)胞和枯否細(xì)胞共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷中LTC4S表達(dá)的調(diào)控，研究AA對其保護(hù)作用及其保護(hù)機(jī)制是否與影響該通路相關(guān)。 方法： 檢測共培養(yǎng)體系中redox相關(guān)因子ROS和GSH量，及redox下游信號ERK和NF-κB信號分子的時(shí)效變化，并通過信號通路特異性抑制劑U0126或redox抑制劑PDTC研究，對共培養(yǎng)體系LTC4S的調(diào)控進(jìn)行研究。

8、以細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)和AST、LDH為指標(biāo)觀察肝細(xì)胞和枯否細(xì)胞共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷的保護(hù)作用。JC-1染色法測定線粒體膜電位，AO-EB觀察細(xì)胞損傷情況，DNA片斷化檢測細(xì)胞有無片段化，熒光探針法檢測共培養(yǎng)體系中ROS和GSH含量。Westernblot方法分析此模型中自三烯合成相關(guān)蛋白5-LO、FLAP、LTC4S和cysLT1R表達(dá)變化。1，3，10μmol/LAA預(yù)處理共培養(yǎng)體系后，再對以上指標(biāo)進(jìn)行檢測。

9、 結(jié)果： 共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷后，呈現(xiàn)ROS生成增加和ERK、NF-κB激活。特異性抑制劑預(yù)處理后，ERK和ROS激活受抑制并伴有一定程度逆轉(zhuǎn)LTC4S表達(dá)上調(diào)；且對共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS所致?lián)p傷有一定保護(hù)作用。細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)和AST、LDH等指標(biāo)均表明AA對肝細(xì)胞和枯否細(xì)胞共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷有保護(hù)作用。JC-1染色結(jié)果、AO-EB和DNA片斷化檢測結(jié)果表明D-GalN/

10、LPS處理后出現(xiàn)凋亡，AA預(yù)處理能部分抑制細(xì)胞凋亡。共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷后ROS生成增加、GSH含量降低和GSH/GSSG比值降低，表明體系內(nèi)氧化還原態(tài)損傷；AA預(yù)處理部分逆轉(zhuǎn)氧化還原態(tài)失衡。AA預(yù)處理抑制共培養(yǎng)體系D-GalN/LPs損傷所致5-LO、FLAP、LTC4S和cysLT1R表達(dá)上調(diào)和cys-LT增加。 結(jié)論： D-GalN/LPS損傷肝細(xì)胞和枯否細(xì)胞共培養(yǎng)體系中LTC4S表達(dá)受redox信號