大鼠肝缺血再灌注損傷的線粒體機(jī)制研究及積雪草酸靶向線粒體解偶聯(lián)的肝保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　本課題通過建立大鼠肝缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）模型和大鼠肝線粒體缺氧復(fù)氧（Anoxia/reoxygenation,A/R）損傷模型，研究肝I/R損傷的相關(guān)線粒體機(jī)制，提出線粒體保護(hù)的重要性。同時，首次研究積雪草酸（Asiatic acid, AA）對大鼠肝I/R損傷的保護(hù)作用及相關(guān)線粒體機(jī)制。在離體線粒體水平和細(xì)胞水平探討AA對線粒體功能的直接影響，從線粒體水平深入闡明其肝保護(hù)作

2、用機(jī)制。利用藥物親和反應(yīng)性的靶點(diǎn)穩(wěn)定性（drug affinity responsive target stability,DARTS）技術(shù)確定AA在小鼠肝臟線粒體上的直接作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步闡明其活性的機(jī)制。
　　方法：
　　健康雄性SD大鼠30只，質(zhì)量230-250g，隨機(jī)分為5組(n=6)，包括假手術(shù)組(SHAM組)、肝I/R組和不同劑量AA組。SHAM組僅暴露肝門，不夾閉血管。IR組采用夾閉左、中葉肝蒂、門靜脈和肝動脈支

3、1 h，然后松開血管夾恢復(fù)血流6 h的方法制備大鼠肝I/R模型。AA組于肝缺血前12 h和1 h分別灌胃給藥兩次。各實(shí)驗(yàn)組于再灌注6 h抽取下腔靜脈血樣并取肝組織。采用試劑盒測定血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性和TNF-α含量；通過HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化；采用試劑盒檢測肝組織中ATP和MDA水平以及SOD、過氧化氫酶活性。再灌注6 h后，采用差速離心法分離各組肝線粒體，Clark氧電極法檢測線粒體呼吸功能；采用試劑盒檢測線粒

4、體中ATP和MDA水平；利用羅丹明123（Rhodamine123,Rh123）熒光探針檢測線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential,MMP）。差速離心法分離健康大鼠肝線粒體，采用Amplex red/辣根過氧化物酶法檢測AA對不同底物條件下線粒體ROS生成的影響。利用Clark氧電極建立線粒體A/R損傷模型，通過線粒體在密閉體系中的呼吸耗氧誘導(dǎo)缺氧，缺氧5 min后，加入新鮮呼吸介質(zhì)實(shí)現(xiàn)復(fù)氧，然后

5、加入ADP后測定線粒體呼吸參數(shù)。通過Amplex red/辣根過氧化物酶法檢測線粒體A/R生成的ROS。
　　分別采用密度梯度離心和差速離心法分離小鼠腦和肝線粒體。利用Clark氧電極研究線粒體呼吸和細(xì)胞呼吸耗氧速率。分別采用DCFH-DA熒光探針和Amplex red/辣根過氧化物酶法檢測小鼠腦和肝線粒體呼吸過程中ROS的產(chǎn)生。利用Rh123和JC-1熒光探針分別檢測離體線粒體和HepG2細(xì)胞的MMP。肝線粒體鈣的釋放以Calc

6、ium Green5N作為探針，通過熒光分光光度計(jì)動態(tài)監(jiān)測。ATP的含量使用ATP檢測試劑盒測定。鈣離子誘導(dǎo)的線粒體腫脹和線粒體在低滲性醋酸鉀中的腫脹通過紫外分光光度計(jì)檢測540 nm吸光度的變化來分析。利用臺盼藍(lán)染色法測定細(xì)胞存活率。細(xì)胞凋亡和壞死利用Annexin V/PI雙染染色試劑盒通過流式細(xì)胞儀來評估。肝細(xì)胞線粒體和HepG2細(xì)胞細(xì)胞色素c的釋放通過Western blot法檢測。HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量采用葡萄糖檢測試劑

7、盒（葡萄糖氧化酶法）測定。
　　利用差速離心法分離小鼠肝線粒體。線粒體經(jīng)M-PER裂解后，和不同濃度的AA在30℃條件下孵育，然后制備DARTS樣品。樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離后利用銀染進(jìn)行分析。差異條帶切膠回收，用蛋白質(zhì)譜分析目的條帶，質(zhì)譜測試原始文件用BioworksBrowser3.3軟件通過蛋白數(shù)據(jù)庫比對確定目標(biāo)蛋白。用Western blot驗(yàn)證靶點(diǎn)蛋白。原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，利用不同濃度的AA處理3小時，MTT法檢測細(xì)

8、胞活力，通過試劑盒測定肝細(xì)胞的氨消耗和尿素生成量。
　　結(jié)果：
　　大鼠肝I/R誘導(dǎo)了明顯的肝損傷，包括血清中AST和TNF-α的釋放增加，肝組織細(xì)胞壞死，標(biāo)志組織氧化損傷的MDA水平上升，SOD和過氧化氫酶的活性下降。50 mg/kg劑量AA處理可顯著減輕大鼠肝I/R引起的肝損傷，抑制AST和TNF-α的釋放，肝細(xì)胞壞死明顯減輕。另外，AA還能明顯抑制肝I/R誘導(dǎo)的MDA的生成，顯著提高肝組織SOD和過氧化氫酶的活性，表明

9、AA能通過減輕氧化應(yīng)激而改善I/R誘導(dǎo)的肝損傷。在對分離的各組大鼠肝線粒體的研究中發(fā)現(xiàn)，肝I/R誘導(dǎo)了明顯的線粒體損傷，表現(xiàn)為呼吸功能嚴(yán)重受損，MMP下降，ATP合成障礙。I/R組大鼠肝線粒體三態(tài)呼吸速率下降，四態(tài)呼吸速率上升，RCR（Respiratory control ratio,RCR）和ADP/O值均明顯降低。另外，I/R組大鼠肝線粒體發(fā)生明顯的氧化損傷，表現(xiàn)為線粒體的MDA水平上升。50 mg/kg劑量AA能明顯對抗肝I/R

10、誘導(dǎo)的肝線粒體損傷，保護(hù)MMP，改善呼吸作用，促進(jìn)ATP合成。另外，AA給藥顯著降低了肝線粒體的MDA水平，提示AA的保護(hù)作用和減輕I/R誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷有關(guān)。在對正常大鼠肝線粒體呼吸作用的研究中發(fā)現(xiàn)，無論添加魚藤酮與否，AA都能劑量依賴性的抑制以琥珀酸鹽為底物的線粒體呼吸產(chǎn)生的ROS。特別是當(dāng)體系中不含魚藤酮時，ROS的生成明顯增加，但AA的抑制活性也顯著增強(qiáng)。這說明AA能夠有效的抑制由于RET在線粒體復(fù)合物I上產(chǎn)生的大量ROS。

11、另外，本研究成功制備了離體大鼠肝線粒體A/R損傷模型，發(fā)現(xiàn)線粒體A/R會導(dǎo)致線粒體功能受損，表現(xiàn)為三態(tài)呼吸速率下降，四態(tài)呼吸速率上升，RCR和ADP/O值均明顯降低。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用谷氨酸鹽和蘋果酸鹽作為底物時相比琥珀酸鹽（添加魚藤酮），線粒體的損傷更加嚴(yán)重，ROS生成也明顯增加，這可能和體系中存在復(fù)合物Ⅱ到復(fù)合物Ⅰ的RET有關(guān)。AA對谷氨酸鹽和蘋果酸鹽作為底物時離體肝線粒體A/R損傷的保護(hù)作用更為明顯，表現(xiàn)為提高三態(tài)呼吸速率，降

12、低四態(tài)呼吸速率，RCR和ADP/O值均明顯上升。
　　分離的小鼠腦線粒體經(jīng)過AA處理后，以琥珀酸鹽為底物的線粒體四態(tài)呼吸速率明顯提高，RCR值降低。AA還能誘導(dǎo)腦線粒體MMP的下降，有一定的劑量依賴性。此外，鈣離子誘導(dǎo)的腦線粒體腫脹也能被AA所抑制。AA處理離體小鼠肝線粒體，能夠顯著刺激以琥珀酸鹽為底物的四態(tài)呼吸速率，導(dǎo)致RCR值下降，降低MMP和ATP水平，誘導(dǎo)線粒體鈣離子的釋放。高濃度的AA能夠使線粒體中ATP的含量明顯下降，

13、并促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放。此外，AA對小鼠腦和肝線粒體線粒體呼吸產(chǎn)生的ROS也有顯著的抑制作用。上述結(jié)果表明，AA能直接作用于線粒體，并且是一種線粒體解偶聯(lián)劑。本研究還發(fā)現(xiàn)AA雖然能抑制鈣離子誘導(dǎo)的線粒體腫脹，但是和經(jīng)典的質(zhì)子型解偶聯(lián)FCCP相比，AA不能誘導(dǎo)線粒體在低滲性醋酸鉀中的腫脹。質(zhì)子型解偶聯(lián)劑的抑制劑6Kch也對AA誘導(dǎo)的解偶聯(lián)作用沒有明顯影響。另外，AA誘導(dǎo)的MMP的下降和鈣離子的釋放是個緩慢的過程，這和強(qiáng)解偶聯(lián)劑FCCP誘導(dǎo)

14、的瞬時的強(qiáng)烈反應(yīng)明顯不同，表明AA是一種溫和的非質(zhì)子型解偶聯(lián)劑。高劑量的AA可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞MMP的快速下降、ATP的耗竭和細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞漿中，從而誘導(dǎo)細(xì)胞快速死亡；低劑量的AA能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞的呼吸耗氧和葡萄糖攝取，提示AA在細(xì)胞水平的解偶聯(lián)作用。通過二磷酸鳥苷（Guanosine diphosphate,GDP）抑制解偶聯(lián)蛋白（Uncoupling protein,UCP）或通過蒼術(shù)苷（Carboxyatrac

15、tyloside,Catr）抑制腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（Adenine nucleotide transporter,ANT）可減弱AA對線粒體呼吸、MMP、線粒體鈣離子釋放和HepG2細(xì)胞死亡的影響。當(dāng)兩種抑制劑聯(lián)合使用，AA介導(dǎo)的解偶聯(lián)作用明顯減輕。
　　小鼠肝線粒體溫和裂解物和AA在30℃條件下共孵育后，制備了DARTS樣品。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后銀染，結(jié)果顯示，在130 kD和170 kD之間有一蛋白條帶明顯受到了AA的

16、保護(hù)，顯示出對Pronase酶水解抗性。用蛋白質(zhì)譜對目標(biāo)條帶進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨甲酰磷酸合成酶1（Carbamyl phosphate synthetase,CPS1）可能是AA的直接作用靶點(diǎn)。通過Western blot證實(shí)CPS1是AA作用于小鼠肝線粒體的直接靶點(diǎn)。當(dāng)原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞用不同濃度的AA處理后發(fā)現(xiàn)，AA能夠使肝細(xì)胞的氨解毒能力下降，尿素的產(chǎn)生減少，表明AA可以和CPS1結(jié)合，抑制其活性，從而抑制肝細(xì)胞的尿素循環(huán)。

17、
　　結(jié)論：
　　肝I/R能夠誘導(dǎo)肝線粒體嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷，線粒體功能發(fā)生明顯障礙。AA可以通過保護(hù)線粒體功能對抗肝組織損傷。另外，AA可以直接作用于線粒體，是一種新型的線粒體解偶聯(lián)劑。AA能通過抑制RET誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，減輕肝I/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，有效保護(hù)線粒體功能。AA的解偶聯(lián)活性和UCP和ANT的激活有關(guān)。高濃度的AA能夠完全解偶聯(lián)線粒體，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的死亡。另外，AA屬于溫和的解偶聯(lián)劑，能夠在低濃度條件