人腸三葉因子分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在CHO細(xì)胞中表達(dá)實(shí)驗.pdf

1、目的：
　　 克隆人腸三葉因子(humanintestinaltrefoilfactor,hITF)基因片段，構(gòu)建hITF分泌型真核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染入二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO/dhfr-);G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株；用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測其在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的表達(dá)，為進(jìn)一步重組hITF的臨床前研究奠定良好的實(shí)驗基礎(chǔ)

2、。
　　 方法：
　　 1．自行設(shè)計上下游各帶有NheI和EcoRI限制性酶切位點(diǎn)的PCR引物，通過重疊延伸PCR法(splicingbyoverlapextensionPCR,SOE-PCR)獲得hITF基因片段，用限制性核酸內(nèi)切酶NheI和EcoRI分別雙酶切真核載體質(zhì)粒pIRES/dhfr和目的基因hITF片段，用T4DNA連接酶連接pIRES/dhfr質(zhì)粒和hITF片段，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞

3、中，在含有終濃度為100mg/mL氨芐西林(Ampicillin，Amp)的LB固體培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)過夜后，挑取單個陽性菌落擴(kuò)增，提取并純化重組載體質(zhì)粒pIRES/hITF/dhfr。
　　 2．用限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切和DNA測序鑒定所構(gòu)建重組載體pIRES/hITF/dhfr。
　　 3．LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞，隨機(jī)分為三個組：正常對照組、空載體質(zhì)粒組和重組

4、質(zhì)粒組。
　　 4．轉(zhuǎn)染后48h，用700μg/mLG418加壓篩選2周，從而獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
　　 5．提取空載體質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒組細(xì)胞的總RNA，通過RT-PCR檢測hITF在CHO/dhfr-細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄情況。
　　 6．雙抗體夾心ELISA法檢測未轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液、空載體質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒組細(xì)胞上清液中hITF表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功獲得300bp左右的hITF基因，測序結(jié)

5、果證明了hITF基因序列與GenBank中報道的序列相一致。
　　 2．成功構(gòu)建hITF分泌型真核表達(dá)載體pIRES/hITF/dhfr，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞。
　　 3．RT-PCR,后電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組在300bp左右處出現(xiàn)陽性條帶，而空載體質(zhì)粒組未見條帶。
　　 4．雙抗體夾心ELISA法檢測到重組質(zhì)粒組細(xì)胞上清液中有hITF的表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清和空載體質(zhì)粒組細(xì)胞上清液中均未檢測到