Rap1GAP抑制黑色素瘤VEGF自分泌和旁分泌機制研究.pdf

1、目的：構(gòu)建高表達Rap1GAP的黑色素瘤細胞系，研究Rap1GAP的高表達對黑色素瘤成瘤的影響及其機制。探討高表達Rap1GAP的黑色素瘤細胞中，Rap1GAP 對黑色素瘤細胞的合成、分泌VEGF，以及抑制VEGF 作用的機制，并研究VEGF 對黑色素瘤細胞行為學(xué)的影響。探討高表達Rap1GAP的黑色素瘤細胞旁分泌VEGF的功能的作用，以及其對黑色素瘤的血管內(nèi)皮細胞的影響。
　　 方法：以pcDNA-Rap1GAP-Flagge

2、d 質(zhì)粒和pcDNA3.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑色素瘤細胞，將上述細胞皮下注射于裸鼠建立腫瘤模型；比較不同Rap1GAP表達水平細胞成瘤生長的差異；通過免疫組化染色比較不同Rap1GAP表達水平下，新生血管的數(shù)量；應(yīng)用Epac、PD98059以及LY294002等工具藥物激活或抑制Rap1 及其下游信號分子，用免疫印跡方法測定相關(guān)蛋白表達水平；并在不同條件下，用MTT 方法比較VEGF對黑色素瘤細胞生長和增殖的作用及機制；用Transwell和酶

3、譜分析檢測其遷移能力的改變，TUNEL 染色檢測細胞凋亡等生物行為學(xué)改變。收集不同Rap1GAP水平的黑色素瘤細胞培養(yǎng)基上清，用ELISA 方法檢測培養(yǎng)基上清中的VEGF 含量；用此培養(yǎng)基上清交叉培養(yǎng)內(nèi)皮細胞，比較不同Rap1GAP水平的內(nèi)皮細胞對其反應(yīng)的差異；并研究黑色素瘤細胞培養(yǎng)基上清對內(nèi)皮細胞中Rap1GTP水平的影響。并用Western Blot檢測血管形成相關(guān)蛋白的表達水平差異。
　　 結(jié)果：高表達Rap1GAP的黑色

4、素瘤細胞在成瘤瘤體體積，新生血管數(shù)量上較正常表達Rap1GAP的細胞顯著下降；進一步研究表明，在高表達Rap1GAP的黑色素瘤中，HIF-a和VEGF表達顯著下降。細胞免疫印跡結(jié)果與組織檢測結(jié)果相同，體外實驗同樣表明，Rap1GAP 可以抑制Rap1GTP的水平，同時降低HIF-a和VEGF的表達。Epac在體外實驗中可以促進VEGF和p-ERK表達，但是這一效果可以被Rap1GAP和PD98059 取消；VEGF在體外試驗中可以增加R

5、ap1 活性，從而活化ERK和Akt通路，但這種作用同樣為Rap1GAP 抑制；進一步研究表明，VEGF 可以抑制黑色素瘤中的凋亡蛋白，如Caspase 3、Caspase 9的表達，并通過增加Cyclin D1等蛋白的表達而促進細胞增殖，同時提高MMP-9、MMP-2活性；細胞學(xué)實驗結(jié)果與分子生物學(xué)實驗結(jié)果一致，上述作用在高表達Rap1GAP的黑色素瘤細胞中均被抑制。ELISA 結(jié)果顯示，高表達Rap1GAP的黑色素瘤細胞培養(yǎng)基上清中

6、，VEGF的含量較pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的細胞顯著下降；而用黑色素瘤細胞培養(yǎng)基上清交叉培養(yǎng)后，Rap1GTP的水平較普通培養(yǎng)基培養(yǎng)下顯著升高；同時，此升高作用可以被VEGF的抑制劑取消。
　　 結(jié)論：Rap1GAP 對黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的抑制作用，其作用機制可能通過抑制VEGF和HIF-a表達。VEGF在黑色素瘤的生長過程中具有自分泌作用，其作用機制通過Akt和ERK 途徑實現(xiàn)；同時VEGF 不斷刺激黑色素瘤分泌而形成正反

7、饋機制，從而使得細胞的增殖失控，最終導(dǎo)致腫瘤形成；ERK 磷酸化后可以抑制VEGF的mRNA 降解，從而在翻譯水平上增加VEGF表達；Akt 通路活化在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有核心作用，并通過增加HIF-a表達而增加VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；Rap1GAP 可以抑制上述增加VEGF表達的翻譯和轉(zhuǎn)錄作用；同時，Rap1GAP可以抑制VEGF 刺激細胞引起的下游效應(yīng)蛋白表達增加，而抑制VEGF的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 此外，黑色