甘草酸苷對(duì)急性肝壞死小鼠腸分泌成分表達(dá)減少的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 急性肝壞死(acute liver failure,ALF)時(shí)繼發(fā)的感染主要由腸道細(xì)菌易位所致,而腸道免疫屏障遭到破壞是發(fā)生腸道細(xì)菌易位的重要因?yàn)?。分泌成?secretorycomponent,SC)是多聚免疫球蛋白受體(polymeric Ig receptor,pIgR)的胞外段部分,主要負(fù)責(zé)pIgA的轉(zhuǎn)運(yùn)和SIgA的形成,在維護(hù)腸粘膜免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn),ALF時(shí)腸道pIgR/SC表達(dá)減少,

2、從而可導(dǎo)致SIgA分泌合成的減少,使其不能正常地在粘膜表面形成完整的SIgA屏障層,而導(dǎo)致腸源性感染的發(fā)生。甘草酸苷(glycyrrhizin),是甘草類(lèi)制劑的典型代表藥物,具有抗炎、抗氧化、抗過(guò)敏及類(lèi)固醇激素樣作用,被廣泛用于治療肝病及皮膚病等領(lǐng)域,是否glycyrrhizin能影響肝壞死時(shí)腸SC的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)肝壞死模型觀察glycyrrhizin預(yù)先保護(hù)組小鼠腸道SC表達(dá)變化探索glycyrrhizin在預(yù)防急性肝壞死

3、小鼠腸道SC表達(dá)減少中的作用,通過(guò)觀察人結(jié)腸上皮細(xì)胞系Caco-2在glycyrrhizin或在聯(lián)合糖皮質(zhì)激素受體抑制劑(RU486)的作用下,細(xì)胞內(nèi)SC蛋白和SC mRNA的表達(dá)情況以及glycyrrhizin對(duì)SC啟動(dòng)子活性,SC啟動(dòng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-上游刺激因子(USF)的影響,探討glycyrrhizin影響SC表達(dá)的作用機(jī)制,為研究預(yù)防及治療肝壞死時(shí)腸粘膜免疫功能失調(diào)提供新的途徑和理論依據(jù)。
　　 材料與方法
　　

4、 一、材料
　　 1、動(dòng)物:雄性Balb/c小鼠,6～8周,體重18～25克。
　　 2、細(xì)胞:Caco-2細(xì)胞。
　　 3、試劑:GAlN；LPS(Ecoli O127:B8)；Glycyrrhizin；山羊抗小鼠pIgR/SC抗體；小鼠抗小鼠β-actin單克隆抗體；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊二抗；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗小鼠二抗；兔抗山羊SP試劑盒；BCA蛋白濃度測(cè)定液；SYBRRPrimeScriptTM

5、 RT-PCR Kit試劑盒；DEX；山羊抗人pIgR/SC抗體；兔抗人β-actin多克隆抗體；兔抗人USF1多克隆抗體；兔抗人USF2多克隆抗體；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊二抗；FITC標(biāo)記兔抗山羊二抗；胎牛血清；DMSO；RU486。
　　 二、方法
　　 1、動(dòng)物分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性Balb/c小鼠,隨機(jī)分為5組。1組:生理鹽水(NS)對(duì)照組60只；2組:脂多糖(LPS)對(duì)照組60

6、只:3組:D氨基半乳糖(GalN)對(duì)照組60只；4組:急性肝壞死(ALF)模型組60只；5組:Glycyrrhizin預(yù)保護(hù)組(LPS/GalN/glycyrrhizin)60只。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)及分組:參照Liu等的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。①觀察濃度影響:取6組非同代生長(zhǎng)達(dá)融合的細(xì)胞,分別添加0μg/mL,4μg/mL,20μg/mL,100μg/mL,500μg/mL,1000μg/mL glycyrrhizin培養(yǎng)24h,提

7、取總蛋白和總RNA-130℃保存；②觀察時(shí)間影響:取5組非同代生長(zhǎng)達(dá)融合的細(xì)胞,以100μg/mL glycyrrhizin分別處理0h、4h、8h、16h、24h,收集Caco-2細(xì)胞爬片甲醛固定及提取總蛋白和總RNA-130℃保存；③取6組非同代生長(zhǎng)達(dá)融合的細(xì)胞,添加RU486(50nM)聯(lián)合20μg/mL glycyrrhizin或100nM DEX共培養(yǎng)24h,收集Caco-2細(xì)胞提取總蛋白和總RNA-130℃保存。
　　

8、 3、應(yīng)用HE染色觀察肝臟病理改變和電鏡觀察腸組織病理變化。
　　 4、應(yīng)用免疫組化染色、western blot和real-time PCR方法觀察glycyrrhizin對(duì)急性肝壞死小鼠腸道SC表達(dá)下降的影響。
　　 5、應(yīng)用免疫熒光染色、western blot和real-time PCR方法檢測(cè)glycyrrhizin對(duì)Caco-2細(xì)胞SC蛋白及mRNA表達(dá)的影響。
　　 6、應(yīng)用western blo

9、t和real-time PCR方法研究糖皮質(zhì)激素受體抑制劑(RU486)對(duì)glycyrrhizin上調(diào)腸上皮細(xì)胞SC表達(dá)的影響。
　　 7、將重組質(zhì)粒PGL2-SC promoter轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)活性,說(shuō)明glycyrrhizin對(duì)SC基因啟動(dòng)子活性的影響。
　　 8、應(yīng)用western blot和real-time PCR方法研究上游刺激因子(USF)及其mRNA表達(dá),說(shuō)明g

10、lycyrrhizin是否通過(guò)影響USF表達(dá)影響SC基因啟動(dòng)子活性。
　　 結(jié)論：
　　 1.Glycyrrhizin可以有效預(yù)防肝壞死小鼠腸上皮細(xì)胞損傷；
　　 2.Glycyrrhizin可有效預(yù)防肝壞死小鼠腸SC蛋白表達(dá)減少,改善肝壞死小鼠腸粘膜免疫穩(wěn)態(tài)失調(diào),從而保護(hù)腸粘膜上皮細(xì)胞損傷；
　　 3.Glycyrrhizin誘導(dǎo)了肝壞死小鼠腸SC基因表達(dá),使SC蛋白合成增加；
　　 4.Gly

11、cyrrhizin使得Caco-2細(xì)胞pIgR/SC陽(yáng)性細(xì)胞比例及pIgR/SC熒光強(qiáng)度增加；
　　 5.Glycyrrhizin劑量依賴(lài)性及時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)Caco-2細(xì)胞SC蛋白表達(dá)；
　　 6.Glycyrrhizin通過(guò)誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞SC mRNA水平,增加SC蛋白表達(dá)；
　　 7.Glycyrrhizin上調(diào)腸上皮細(xì)胞SC表達(dá)并非通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體；
　　 8.Glycyrrhizin可通過(guò)