小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞及CLIO-Tat標(biāo)記后的活體示蹤研究.pdf

1、第一部分
　　兩種方法誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞
　　目的:探討小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell,ESC)向內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcell,EC)誘導(dǎo)分化的能力,使用兩種方法(三維培養(yǎng)體系和二維體系體系)將ESCs分化為高純度的胚胎干細(xì)胞來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞(murineembryonicstemcell-derivedendothelialcells,ESDECs),比較三維法和二維法ESCs誘導(dǎo)

2、體外定向分化為Ecs的優(yōu)缺點(diǎn)和效率。
　　材料和方法:利用小鼠ESC經(jīng)懸滴法形成擬胚體(embryoidbodies,Ebs)(三維法),Ebs于第3d轉(zhuǎn)懸浮培養(yǎng),第5d貼壁培養(yǎng),開(kāi)始在EGM-2培養(yǎng)液和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)作用下定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcells,Ecs),第9d,以胎肝激酶-1(fetalliverkinase,Flk

3、-1)作為標(biāo)志物進(jìn)行流式分選,分選出Flk-1+的ESDEC。二維法中,ESCs先轉(zhuǎn)至Ⅳ型膠原體系中,用去除白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)的培養(yǎng)液培養(yǎng),第4d,以Flk-1進(jìn)行流式分選,分選后Flk-1+細(xì)胞在纖連蛋白(fibronectin,FN)包被培養(yǎng)皿上繼續(xù)培養(yǎng),EGM-2培養(yǎng)液中額外加入VEGF(50ng/ml)。約1w后,人工分選出鵝卵石形態(tài)的內(nèi)皮樣細(xì)胞并加以純化。所得ESDEC行

4、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、免疫熒光及流式細(xì)胞標(biāo)志物鑒定,評(píng)估PECAM-1、VE-Cadherin、Tie-2、Fit-1、Flk-1、vWF及Oct-4.的mRNA表達(dá)水平,各分化階段PECAM-1、CD34和VE-cadherin的動(dòng)力學(xué)、吞噬Dil-ac-LDL和體外成管能力等細(xì)胞學(xué)行為。
　　結(jié)果:1.ESCs在絲裂霉素處理過(guò)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouseembryonicfibroblasts,MEF)飼養(yǎng)層上和LlF作用下

5、,可以保持未分化狀態(tài),未分化的ESC表現(xiàn)為圓形或橢圓形、平坦、細(xì)胞排列緊密的細(xì)胞團(tuán)。2.利用懸滴法培養(yǎng)出的EB大小均一,形成率高(＞90％),在三維培養(yǎng)體系中EB有出芽等血管新生現(xiàn)象,所形成的管狀結(jié)構(gòu)免疫熒光染色CD31陽(yáng)性,提示主要為ESDECs構(gòu)成。3.二維體系中,Flk-1+細(xì)胞呈現(xiàn)兩種細(xì)胞形態(tài),即鵝卵石樣的內(nèi)皮細(xì)胞樣細(xì)胞和條索狀的平滑肌樣細(xì)胞。經(jīng)過(guò)人工分化和純化,逐漸成為高純度的ESDECs,形態(tài)單一同內(nèi)皮細(xì)胞,并可以長(zhǎng)期傳代。

6、4.兩種方法分化的ESDECs細(xì)胞學(xué)行為與對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(murineaorticendothelialcells,MAECs)相似,可表達(dá)與EC相似的內(nèi)皮細(xì)胞特異性因子,有內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因表達(dá),Dil-ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,可在matrigei上生出管狀結(jié)構(gòu)。5.二維法中流式分選的Flk-1+細(xì)胞比例(23％)要高于三維法(13％),經(jīng)純化后,ESDECs表達(dá)VE-Cadherin的細(xì)胞比例也要高于后者(分別為98％和

7、95％),二維分化體系簡(jiǎn)單有效。
　　結(jié)論:兩種方法均可成功誘導(dǎo):ESCs定向分化為ESDECs,是有效的ESC定向分化為成熟EC的體外細(xì)胞模型,分化出的ESDECs細(xì)胞生物學(xué)行為與MAECs相同,但二維法的效率要高于三維法。
　　第二部分
　　CLIO-Tat標(biāo)記小鼠胚胎干細(xì)胞的體外MR成像及對(duì)其定向內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響
　　目的:確定HIV-Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域交聯(lián)氧化鐵復(fù)合物(HIVtransductiondom

8、aincross-linkedironoxide,CLIO-Tat)標(biāo)記ESCs的最佳標(biāo)記條件,評(píng)估CLIO-Tat標(biāo)記對(duì)ESCs及其定向分化后EC細(xì)胞活力、增殖、細(xì)胞標(biāo)志物等細(xì)胞學(xué)行為有無(wú)影響。
　　材料和方法:本實(shí)驗(yàn)分兩部分:1.分別選用不同濃度CLIO-Tat和標(biāo)記時(shí)間與小鼠ESCs共孵育,然后運(yùn)用普魯士藍(lán)染色、細(xì)胞內(nèi)鐵濃度、體外細(xì)胞凝膠磁共振成像(MagneticResonanceImaging,MRI)評(píng)估標(biāo)記效率;用臺(tái)

9、盼蘭拒染實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞活力、毒性和增殖能力,確定CLIO-Tat標(biāo)記ESCs的最佳標(biāo)記條件。2.利用CLIO-Tat、CLIO或Tat標(biāo)記ESCs,評(píng)估上述不同標(biāo)記物標(biāo)記后ESCs的細(xì)胞活力、細(xì)胞毒性和增殖能力以及細(xì)胞周期和凋亡,并測(cè)定各標(biāo)記組ESCs定向分化(二維法)的ESDECs的細(xì)胞表面標(biāo)志、EC特征性基因表達(dá)成管能力、增殖能力等,了解CLIO-Tat、CLIO以及Tat對(duì)ESC定向分化的影響。
　　結(jié)果:1.使用

10、CLIO-Tat(50μg/ml)標(biāo)記ESCs24h后,普魯士藍(lán)染色可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)有藍(lán)色顆粒,細(xì)胞內(nèi)鐵濃度為(25.3±2.1)pg,CLIO-Tat標(biāo)記對(duì)細(xì)胞活力、增殖、細(xì)胞周期和凋亡等均無(wú)影響,體外凝膠MR成像T2*WI為低信號(hào)。2.CLIO-Tat(50μg/ml)標(biāo)記分選后的ESCs經(jīng)二維體系體外誘導(dǎo)分化為ESDECs,后者的細(xì)胞學(xué)行為與血管內(nèi)皮相似,可表達(dá)與對(duì)照組(MAECs)相似的內(nèi)皮細(xì)胞特異性因子,有內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因表達(dá),D

11、il-ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,可在三維培養(yǎng)體系(matrigel)中生成管狀結(jié)構(gòu),CLIO及Tat標(biāo)記ESCs也未抑制ESDEC的體外成管能力。
　　結(jié)論:1.CLIO-Tat標(biāo)記ESCs的最佳標(biāo)記條件是CLlO-Tat50μg/ml,體外共孵育24h;體外細(xì)胞凝膠MR成像可對(duì)CLIO-Tat標(biāo)記ESCs進(jìn)行有效示蹤,T2*WI是最有效的成像序列。2.CLIO-Tat、CLIO及Tat標(biāo)記ESCs不會(huì)影響ESCs的生物學(xué)行為及其

12、向EC定向分化能力,分化后的ESDECs生物學(xué)行為和對(duì)照組(MAECs)相一致。
　　第三部分
　　CLIO-Tat標(biāo)記小鼠胚胎干細(xì)胞分化的內(nèi)皮細(xì)胞及其移植后的體內(nèi)MRI示蹤研究
　　目的:評(píng)價(jià)CLIO-Tat標(biāo)記mESDECs移植后MR成像活體示蹤的可行性和有效性,并對(duì)CLIO-Tat標(biāo)記ESDECs移植治療小鼠后肢缺血模型的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　材料和方法:建立小鼠后肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ?將ESDECs和ESCs分別

13、與CLIO-Tat-FITC或CLIO共孵育24h,分別注射入動(dòng)物模型缺血肢體肌肉內(nèi)(分組情況為A:CLIO-Tat-FITC標(biāo)記ESDECs移植組、B:CLIO-Tat-FITC標(biāo)記ESCs移植組、C:CLIO標(biāo)記ESDECs移植組、D:PBS注射組)。植入后即時(shí)及每周(1～4w),分別行MRJ。各組動(dòng)物模型制作前及細(xì)胞移植術(shù)后每周(1～4w)激光多普勒血流檢測(cè)后肢血供,并進(jìn)行缺血后肢功能評(píng)分。第4w后取小鼠后肢標(biāo)本,行HE染色和普魯

14、士蘭鐵染色,Ⅷ因子相關(guān)抗原和Mac-3免疫組化染色,并計(jì)算缺血組織的微血管血管密度(Microvesselcounting,MVC)。
　　結(jié)果:使用CLIO-Tat-FITC(50μg/ml)標(biāo)記ESDECs后,普魯士藍(lán)染色和免疫熒光可見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)磁性標(biāo)記顆粒。移植后,MRI可顯示缺血部位植入的ESDECs和ESCs分布和遷移情況,T2*WI為低信號(hào),直到術(shù)后4周。激光多普勒、肢體功能評(píng)分及MVC顯示:磁標(biāo)記細(xì)胞(CLIO-Ta

15、t-FITC標(biāo)記ESDECs、CLIO-Tat-FITC標(biāo)記ESCs和CLIO標(biāo)記ESDECs移植組)植入后肢體血供較對(duì)照組都有改善。組織學(xué)和免疫組織化學(xué)顯示ESCs植入后有畸胎瘤形成可能,ESDECs組則未見(jiàn)。
　　結(jié)論:CLIO-Tat標(biāo)記ESDECs安全有效,標(biāo)記后可運(yùn)用MRI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤。同時(shí),CLIO-Tat標(biāo)記ESDECs移植后能夠促進(jìn)缺血組織的血管新生,改善血供。此外,未分化的ESCs植入后可形成畸胎瘤,分化后