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文檔簡介
1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),原稱綠膿桿菌,是一種革蘭氏陰性菌,在自然界分布廣泛,水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有此菌存在。同時,銅綠假單胞菌也是一類條件致病菌,是醫(yī)院內感染的主要病原菌之一?;即x性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者,以及術后或某些治療后的患者易感染此菌,經常引起肺炎、術后傷口和燒傷面感染,也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等。銅綠假單胞菌引起的感染可導致菌血癥和敗血癥的發(fā)生。燒傷后感
2、染銅綠假單胞菌可能會造成患者死亡。由于銅綠假單胞菌的內在性和獲得性多重耐藥性,導致對其的治療變得很困難。銅綠假單胞菌的內在多重耐藥性,是外膜低通透性和大量外排系統(tǒng)共同作用的結果。目前,在銅綠假單胞菌中已發(fā)現(xiàn)了5類外排系統(tǒng)家族。其中,RND(resistance-nodulation-celldivision)外排泵系統(tǒng)是這些外排系統(tǒng)家族中重要的一員,與抗生素外排直接相關;幾乎所有此類外排泵家族成員都與細菌耐藥性相關,是細菌耐藥性產生的主
3、要因為之一。因此,研究銅綠假單胞菌中RND外排泵,揭示細菌耐藥機理,篩選外排泵抑制子,對了解和控制銅綠假單胞菌耐藥性具有重要意義。雖然現(xiàn)在對銅綠假單胞菌RND外排泵的研究已經有很多,但是,一些重要的基本問題還沒有解決。
本研究以銅綠假單胞菌中RND外排泵家族成員為研究對象,構建了12個RND外排泵單突變體;同時結合以無啟動子的熒光素酶基因操縱子luxCDABE為報道基因,構建了檢測12個RND外排泵表達的報道子,對銅綠假單
4、胞菌中RND外排泵家族進行研究。主要針對銅綠假單胞菌中RND外排泵家族成員的表達水平比較;鋅離子(Zn2+)對外排泵基因表達水平的調節(jié);外排泵家族成員外排抗菌制劑時的主次地位進行了系統(tǒng)的研究。具體研究內容和結果包括:
第一部分,對銅綠假單胞菌中RND外排泵家族成員的表達譜、鋅離子對其表達的誘導、RND外排泵在抗生素耐藥性中的作用進行了系統(tǒng)的研究。研究結果顯示:除了已報道的四個RND外排泵mexAB-oprM,mexPQ,m
5、exVW,mexXY,在銅綠假單胞菌中mexJK和muxABC.opmB也屬于組成型表達;RND外排泵中mexAB-oprM,mexJK,mexXY和czcCBA的啟動子表達受到硫酸鋅的明顯誘導.而且czcCBA受誘導程度最顯著。
通過抗生素耐藥性實驗發(fā)現(xiàn):MexAB-OprM突變體對多種抗生素的抗性下降:而MexGHI-OpmD和MuxhsC-OpmB突變體表現(xiàn)出抗生素抗性升高;同時,除了CzcCBA突變體,MexGHI
6、-OpmO和MexXY-OprM突變體對鋅離子抗性下降。同時,實驗結果表明:CzcCBA的單突變體,PAO(△czcC)在有硫酸鋅存在下,表現(xiàn)出對多種抗生素敏感性增大,揭示金屬離子對抗生素抗性的影響。這些結果表明:在RND外排泵中,MexAB-OprM是外排泵家族中發(fā)揮主要作用的外排泵家族成員,對氯霉素、環(huán)丙沙星、土霉素、四環(huán)素和鏈霉素的外排起到第一級的作用;MexAB-OprM和MexEF-OprN在外排泵家族中,對氨芐青霉素的外排起
7、到第一級的作用;CzcCBA,MexGHI-OpmD和MexXY-OprM在外排泵家族中,對鋅離子的外排起到第一級的作用;鋅離子在銅綠假單胞菌的抗生素抗性中也發(fā)揮著重要的作用;
第二部分,對當時功能未知的RND外排泵家族成員MuxhsC-Opm8的抗性和致病性等特點進行深入的研究。這一RND泵功能在2009年已有報道,但本研究通過抑菌實驗和致病力實驗首次發(fā)現(xiàn),這個外排泵的單突變可以導致銅綠假單胞菌對抗生素氨芐青霉素和羧芐青
8、霉素抗性升高,并造成致病力下降。證明MuxhsC-Opm8不僅與銅綠假單胞菌的抗生素抗性相關,也和細菌的致病性相關;而致病力的下降至少部分因為是由于突變體蹭行運動能力喪失造成的;
第三部分,本研究以czcCBA表達水平受鋅嚴格調控特為依據(jù),構建了一組在假單胞菌屬細菌中可控的表達系統(tǒng)-pLY系統(tǒng)。通過連入lux報道基因和sacB基因,對這套表達系統(tǒng)的可控性進行了驗證,實驗結果表明,本研究構建的表達系統(tǒng)只能在假單胞菌屬細菌中作
9、用,鋅離子的濃度能夠控制連入基因的表達強度,且其在轉錄水平上表現(xiàn)為對鋅離子濃度梯度依賴;
第四部分,利用同源性比較,在銅綠假單胞菌中找到了6個金屬離子外排泵(CzcD1、CzcD2、ZntA1、ZntA2、YvgX和YiiP),并構建了它們的報道子和突變體;以此為基礎,檢測了抗生素和金屬離子對它們表達水平的影響,以及它們是否具有對抗生素和金屬離子的雙重外排功能。結果表明,雖然不同抗生素對這六個金屬離子外排泵的表達有不同程度
10、的影響,但沒有檢測到明顯的金屬離子和抗生素的協(xié)同誘導作用:藥物敏感性實驗結果表明:ZntA1參與到鎘和鋅的外排,ZntA2與鎘的抗性有關;CzcD2突變體表現(xiàn)出鉆的敏感性升高。但是,這些單突變體的抗生素敏感性變化不明顯。
綜上所述,本研究對銅綠假單胞菌中RND外排泵家族所有成員的基因表達調節(jié)、功能特點、外排泵家族成員外排抗菌制劑中的主次地位,以及金屬離子對銅綠假單胞菌的抗性影響進行了系統(tǒng)研究。對銅綠假單胞菌的耐藥性、致病力
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