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文檔簡介
1、目的:
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA),又稱綠膿桿菌,屬假單胞菌屬,廣泛分布于自然界、人體的皮膚、腸道和上呼吸道中,具有多重耐藥性的特點,其分離率在非發(fā)酵菌中居于首位。銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌,也是引起嚴(yán)重的醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的常見病原菌之一,如中性粒細胞減少癥、嚴(yán)重?zé)齻蚰倚岳w維化,嚴(yán)重危害著人類的健康和生命。隨著抗菌藥物的廣泛使用,抗菌耐藥株的不斷出現(xiàn)和傳播,使得治療方法越來越有
2、限;結(jié)果,銅綠假單胞菌感染顯示出高發(fā)病率和死亡率。因此,探討銅綠假單胞菌的耐藥機制,對于控制由銅綠假單胞菌引起的感染有重要的意義。
雙組分系統(tǒng)(two component syste m,TCS)廣泛存在于銅綠假單胞菌中,文獻報道在某些TCS的突變情況下,銅綠假單胞菌中的PA1797基因表達量比某些基因表達量都要大,如PA2572/PA2573,PA2572基因突變使PA1797基因升高56.2倍;CbrAB,CbrA基因突變
3、使PA1797基因升高10.37倍;而在PhoPQ和ParRS突變中PA1797基因表達量相對較小。在Pseudomonas aeruginosa基因組數(shù)據(jù)庫(www. pseudomonas.com)中,PA1797基因被定義為一個功能未知的新基因,目前有關(guān)PA1797基因的報道尚不多見,PA1797基因的功能尚不明確。本文采用抗生素敏感實驗、綠膿素產(chǎn)量、殺菌、運動能力和生物膜培養(yǎng)等實驗對PA1797基因的功能進行探討。
方
4、法:
(1)PCR擴增 PA1797同源臂與四環(huán)素抗性基因插入自殺質(zhì)粒 pEX18-Tc,構(gòu)建 PA1797基因敲除載體,利用雙親雜交轉(zhuǎn)化銅綠假單胞菌 PAO1,構(gòu)建PA1797基因突變株P(guān)CKH33。
?。?)PCR擴增PA1797-1基因編碼片段,插入pJN105質(zhì)粒阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子的下游,構(gòu)建PA1797基因表達載體,轉(zhuǎn)化PA1797基因突變株P(guān)CKH33,構(gòu)建PA1797基因補償株P(guān)CKH36。
5、(3)通過抗生素敏感實驗、運動實驗、殺菌實驗、綠膿素產(chǎn)量實驗,觀察野生株、突變株及補償株變化。
(4)用Trizol法抽提銅綠假單胞菌的總RNA,Real-time熒光定量PCR檢測在PA1797基因突變情況下其他相關(guān)毒力基因表達情況。
?。?)生物膜培養(yǎng),結(jié)晶紫染色后用熒光相差顯微鏡觀察野生株、突變株及補償株變化。
結(jié)果:
?。?)經(jīng)PCR及測序,證明銅綠假單胞菌突變株P(guān)CKH33中缺失PA1797
6、基因,成功構(gòu)建銅綠假單胞菌PA1797基因突變株P(guān)CKH33。
?。?)經(jīng)PCR及測序,證明成功構(gòu)建過表達質(zhì)粒pJN105-PA1797-1和銅綠假單胞菌補償株P(guān)CKH36。
?。?)與野生株相比較,突變株對美羅培南、頭孢他啶和喹諾酮類的抑菌圈變?。挥緞幽芰τ忻黠@區(qū)別;喪失殺菌能力;綠膿素產(chǎn)量減少。
?。?)與野生株相比較,突變株Ⅲ型分沁系統(tǒng)中的exoS基因相對表達量明顯下降。
?。?)與野生株相比較,突
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