銅綠假單胞菌氨基糖苷類(lèi)耐藥基因的研究.pdf

1、目的:
　　本文應(yīng)用高通量測(cè)序以及基因組生物信息分析，以臨床分離的不同年份的銅綠假單胞菌(PA)為研究對(duì)象，研究已經(jīng)報(bào)道過(guò)的所有氨基糖苷類(lèi)耐藥基因在PA中的分布情況;并發(fā)掘PA中氨基糖苷類(lèi)耐藥新基因型，克隆候選基因，通過(guò)藥敏試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證新基因型的功能。進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為銅綠假單胞菌所攜帶的耐藥基因分布規(guī)律、傳播機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　本課題以溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離得到的239株P(guān)A

2、為樣本，提取其混合基因組，并送至北京中科院基因組研究所進(jìn)行solexa測(cè)序。通過(guò)一系列生物信息學(xué)工具，將測(cè)序得到的短序列與收集到的151條已報(bào)道氨基糖苷類(lèi)耐藥基因序列比對(duì)分析，研究這151條氨基糖苷類(lèi)耐藥基因在PA中的分布情況及豐度差異。同時(shí)進(jìn)一步發(fā)掘新的耐藥基因型，選取其中的aadA4基因型為代表，設(shè)計(jì)引物PCR定位該基因所在的菌株。PCR篩選出的陽(yáng)性菌株中的aadA4基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息分析，研究該基因的同源性和分子進(jìn)化。將aad

3、A4新基因型片段連接到T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，提取重組子質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，再將片段連接到pET-15b載體，轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21，涂布于含Amp平板上進(jìn)行培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性菌株pET∷aadA4/BL21。然后通過(guò)瓊脂倍比稀釋法測(cè)定pET∷aadA4/BL21對(duì)17種藥物的MIC值，來(lái)驗(yàn)證銅綠假單胞菌中aadA4新基因型的功能。同時(shí)藥敏試驗(yàn)也研究了選取的45株銅綠假單胞菌對(duì)17種藥物的MIC值，觀察該院分離的銅綠假單胞菌的

4、對(duì)抗生素的耐藥性情況以及分析aadA4基因陽(yáng)性株與陰性株耐藥性的差異。
　　結(jié)果:
　　1.銅綠假單胞菌混合基因組高通量測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生的短序列reads總數(shù)有70，239，195條，reads的長(zhǎng)度均為100nt。將reads比對(duì)到151條氨基糖苷類(lèi)耐藥基因序列上，最后發(fā)現(xiàn)有25個(gè)基因型存在于銅綠假單胞菌中。其中豐度最高的基因型為aph(3')-Ⅱb，豐度有1636.218X，覆蓋度99.88％;豐度最低的基因型是aadA41

5、2，豐度有2.2X，覆蓋度80.1％。
　　2.從239株銅綠假單胞菌中，PCR篩選出兩株菌TL1229、TL1285，包含有aadA4基因型，其余銅綠假單胞菌均不含aadA4基因型。
　　3.PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果分析，TL1229與TL1285中的aadA4基因型比對(duì)identity為100％，TL1229、TL1285中的aadA4基因型與參照序列aadA4比對(duì)identity為95％，且發(fā)生了氨基酸水平的差異。
　

6、　4.aadA4新基因型進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)與大腸桿菌中的YP_190214蛋白親緣關(guān)系最近，銅綠假單胞菌中aadA4基因的來(lái)源可能是由大腸桿菌水平轉(zhuǎn)移而來(lái)。
　　5.成功將aadA4基因連接到pET-15b表達(dá)載體，并成功構(gòu)建表達(dá)目的重組菌pET∷aadA4/BL21。
　　6.MIC功能驗(yàn)證，TL1229、TL1285中發(fā)現(xiàn)的aadA4新基因型對(duì)鏈霉素、大觀霉素和新霉素的MIC值比對(duì)照組高出4個(gè)濃度梯度左右，對(duì)其他抗生素

7、則沒(méi)有明顯的作用。
　　7.醫(yī)院分離的銅綠假單胞菌對(duì)鏈霉素、大觀霉素、核糖霉素、頭孢唑啉鈉、氨芐西林鈉和替卡西林具有很強(qiáng)的耐藥作用，MIC值達(dá)到了1024μg/mL以上。TL1285、TL1185、TL1208、TL1288、TL1289這五株菌幾乎對(duì)所有的藥物MIC都很高，相比于其它銅綠假單胞菌，尤其對(duì)卡那霉素、妥布霉素、新霉素、慶大霉素、西索米星、小諾米星、阿米卡星、奈替米星的MIC值均達(dá)到了128μg/mL以上。
　　

8、結(jié)論:
　　1.高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息工具的結(jié)合，能使我們?cè)诙虝r(shí)間內(nèi)測(cè)定上百株細(xì)菌的核酸序列，通過(guò)對(duì)病原菌序列進(jìn)行大規(guī)模分析來(lái)探索基因組序列結(jié)構(gòu)與病原微生物的耐藥性的關(guān)系，對(duì)于致病菌中耐藥基因的分布及新基因的發(fā)掘和功能研究起著極為有效的作用，為新藥的研制開(kāi)發(fā)提供了新的思路。
　　2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分離的銅綠假單胞菌中含有豐富的氨基糖苷類(lèi)耐藥基因，并且已經(jīng)產(chǎn)生多重耐藥菌株。
　　3.銅綠假單胞菌菌株TL122