銅綠假單胞菌的耐藥

1、銅綠假單胞菌耐藥研究進(jìn)展,,1.銅綠假單胞菌的流行病學(xué)、病原學(xué)、臨床意義2.銅綠假單胞菌的實(shí)驗(yàn)室檢查3.銅綠假單胞菌感染的治療方案4.銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制5.研究進(jìn)展,,,主要內(nèi)容,流行病學(xué),本菌為條件致病菌，廣泛存在于自然界、土壤、水、空氣，在正常人皮膚（如腋下、會(huì)陰部和耳道內(nèi)）、呼吸道和腸道均存在。其生存的重要條件是潮濕環(huán)境，對(duì)外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，濕熱55℃ 、1h方能殺滅，對(duì)紫外線不敏感。兒童帶菌率比成人高,

2、應(yīng)用抗生素治療者帶菌率增高。住院病人，特別是使用抗生素、糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療的病人，呼吸道內(nèi)該菌的寄植增多。,流行病學(xué),感染途徑：內(nèi)源性：自身上呼吸道、腸道、皮膚、生殖道等外源性：其他病人或帶菌的健康工作人員，經(jīng)手、飛沫或污染的醫(yī)療器械而傳播。,病原學(xué),革蘭氏陰性桿菌，單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列。多數(shù)菌株分泌綠膿菌素和熒光素，呈藍(lán)綠色，故名綠膿桿菌。菌體一端有1～3根鞭毛，故有動(dòng)力，較活潑，無莢膜或芽胞。專性需氧菌，生長要

3、求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，最適宜溫度為35℃。有很強(qiáng)的蛋白分解能力，但發(fā)酵糖類能力低。,致病性,,臨床意義,經(jīng)常引起術(shù)后傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可導(dǎo)致血行散播，而發(fā)生菌血癥和敗血癥。燒傷后感染了銅綠色假單胞菌可造成死亡。本菌所致感染的臨床表現(xiàn)取決于受累部位。,,,化膿性內(nèi)眼炎,繼發(fā)性銅綠假單胞菌感染,膿液 痰 尿液等血液 環(huán)境用品

4、 分離培養(yǎng) 直接涂片染色肉湯增菌 血平板、MAC 37 ℃18-24h 可疑菌落（金屬光澤、β-溶血、產(chǎn)綠色素、特殊氣味） 初步鑒定 最后鑒定

5、 菌落 色素 非發(fā)酵菌鑒定系統(tǒng)鑒定 革蘭陰性桿菌 氧化酶(+) 血清分型 檢驗(yàn)程序,,,,,,,,,,,,為革蘭陰性菌，菌體大?。?.5～5.0)um×寬

6、(0.5～1)um，細(xì)長且長短不一，有時(shí)呈球桿狀或線狀，成對(duì)或短鏈狀排列。菌體的一端有單鞭毛，無芽胞,革蘭染色,電鏡,直接檢鏡,分離培養(yǎng),專性需氧、營養(yǎng)要求不高普通培養(yǎng)基： 18-24h圓形 、大小不一、 邊緣不整 扁平、 濕潤 、金屬光澤常呈融合態(tài)， 瓊脂被染成綠或黃綠 。MAC：微小無光澤半透明 48h后菌落呈棕色血平版：扁平 濕潤 有金屬光澤 瓊脂被染成藍(lán)綠或灰綠 有透明溶血環(huán)有特殊生姜?dú)馕?普通平板,MA

7、C平板,血平板,生化實(shí)驗(yàn),該菌氧化酶陽性，能氧化分解葡萄糖和木糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，但不分解乳糖和蔗糖。液化明膠、可分解尿素，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽并產(chǎn)生氮?dú)?，吲哚陰性，利用枸櫞酸鹽，精氨酸雙水解酶陽性。生長實(shí)驗(yàn)：該菌在4℃不生長而在42℃可以生長分型（1）噬菌體分型：所應(yīng)用的噬菌體現(xiàn)有24株，分型率達(dá)90%。（2）血清學(xué)分型：利用O抗原進(jìn)行分型，可分20個(gè)血清型。（3）核酸檢測：質(zhì)粒指紋圖譜分型、脈沖場凝膠電泳分型、其他快速分

8、子生物學(xué)（基因芯片、PCR技術(shù)、16SrDNA分型）鑒定,常見非發(fā)酵菌初步分群鑒定,試驗(yàn) 假單胞 不動(dòng)桿 產(chǎn)堿桿 黃桿 莫拉 菌屬 菌 屬 菌 屬 菌屬 菌屬 氧化酶 + - + + + 葡萄糖O/

9、F O/- O/- - O/F - 動(dòng)力 + - + - - MAC平板生長 + + + +/- -,,,,鑒定,初步鑒定 菌體形態(tài) 菌落特征 產(chǎn)色素 氣味 氧化酶

10、最終鑒定 非發(fā)酵菌生化鑒定系統(tǒng) API-NE試條 注意：實(shí)驗(yàn)室診斷應(yīng)與臨床表現(xiàn)相結(jié)合,藥物治療,傳統(tǒng)藥物治療,,,哌拉西林，替卡西林頭孢他啶，頭孢哌酮哌拉西林/他唑巴坦替卡西林/克拉維酸頭孢哌酮舒巴坦環(huán)丙沙星，左氧氟沙星多粘菌素類（多粘菌素類B、E）,新研發(fā)的抗假單胞菌藥物,多利培南（Doripenem）西他沙（sitafloxacin）比阿培南（Biapenem）,銅綠假單胞菌對(duì)以下藥物具有天然耐

11、藥性：氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、第一、二代頭孢菌素、頭孢噻肟、頭孢曲松、萘啶酸和甲氧嘧啶等。,耐藥機(jī)制,,,耐藥機(jī)制,1.外膜通透性減低2.主動(dòng)外排泵系統(tǒng)3.抗菌藥物作用的靶位的改變4.產(chǎn)生滅活酶5.生物膜（BF）的形成,1. 外膜通透性障礙,抗生素通過兩種途徑進(jìn)入細(xì)菌外膜，親水性抗生素的孔蛋白通道和疏水性抗生素的脂質(zhì)介導(dǎo)通道。如果這些通道改變或缺失，抗生素將不能進(jìn)入細(xì)菌到達(dá)作用靶位，從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性

12、。PA的外膜通透性極低，僅為大腸埃希菌的1%-8%，這是PA對(duì)多種抗生素天然耐藥的重要原因之一。β內(nèi)酰胺類、四環(huán)素、氯霉素、喹諾酮類只能通過孔蛋白提供的水通道跨越外膜。,1. 外膜通透性障礙,PA外膜蛋白中的OprC、OprD、OprE是小分子親水性抗生素進(jìn)入細(xì)菌的通道，OprF形成大孔通道?？椎鞍讛?shù)量的減少或基因突變影響外膜對(duì)抗生素的通透性?？椎鞍仔纬傻耐ǖ啦糠志哂刑禺愋?，如OprD2孔道是亞胺培南選擇性快速進(jìn)入菌體的特異性通道，

13、如果OprD2蛋白缺失或者表達(dá)減少是導(dǎo)致PA對(duì)亞胺培南耐藥的機(jī)制之一，但對(duì)美羅培南卻無影響。,1. 外膜通透性障礙,氨基糖苷類和多粘菌素E并不通過外膜孔蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而是先粘附在外膜的脂多糖上，再促進(jìn)自身被細(xì)菌攝入，干涉細(xì)菌核糖體蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而產(chǎn)生抗菌作用。OprH的過度表達(dá)可防礙氨基糖苷類和多粘菌素E的粘附作用，從而導(dǎo)致耐藥，但是這種耐藥形式尚未在臨床菌株中廣泛發(fā)現(xiàn)。,2.主動(dòng)外排泵系統(tǒng),外排泵由三部分組成：①外膜蛋白：形成門

14、通道，有利于底物通過外膜；②膜融合蛋白或連結(jié)蛋白，連接內(nèi)、外膜蛋白；③內(nèi)膜蛋白，為主要的泵出蛋白，具有識(shí)別底物的作用，但不具特異性。,3.藥物作用靶位的改變,青霉素結(jié)合蛋白（penicilin binding proteins,PBPs） PBPs數(shù)量、結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致其與抗生素親和力降低，產(chǎn)生緩慢結(jié)合的PBPs或者誘導(dǎo)性PBPs增多均能導(dǎo)致PA對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥。,◆ DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ位點(diǎn)改變,◆

15、 此外，二氫葉酸合成酶發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，可使磺胺類藥物的親和力降低，從而引起對(duì)磺胺類藥物耐藥；,◆ 氨基糖苷類抗生素的作用靶位16SrRNA發(fā)生基因突變也可導(dǎo)致PA對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥。,3. 產(chǎn)生滅活酶（ 氨基糖苷類修飾酶）,AMEs由質(zhì)粒編碼，可分為乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和核苷酸轉(zhuǎn)移酶三類。氨基糖苷類修飾酶（AMEs）能將氨基糖苷類抗生素的游離氨基乙酰化，將游離羧基磷酸化、核苷化，使氨基糖苷類抗生素發(fā)生鈍化，不易進(jìn)

16、入菌體內(nèi)，也不易與細(xì)菌內(nèi)靶位（核糖體30S亞基）結(jié)合，從而失去抑制蛋白質(zhì)合成的能力，因此細(xì)菌在抗生素存在的情況下仍能存活。,4. 產(chǎn)生滅活酶（ β內(nèi)酰胺酶BLA ）,超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBLs） 又稱金屬酶或碳青霉烯酶，MBLs通過半胱氨酸、組氨酸、天冬氨酸等活性位點(diǎn)的氨基酸與鋅離子結(jié)合，鋅再結(jié)合水分子使其活化，成為親核試劑，從而水解包括碳青霉烯類在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，其活性不能被

17、克拉維酸、他唑巴坦等常見的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制。主要由假單胞菌屬、脆弱擬桿菌屬、產(chǎn)黃菌屬、沙雷菌屬及嗜麥芽黃單胞桿菌屬產(chǎn)生。頭孢菌素酶（AmpC酶） AmpC酶作用于頭孢菌素，但不被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制。PA中的AmpC酶是典型的誘導(dǎo)酶。產(chǎn)生菌主要是革蘭陰性菌，如假單胞菌、腸桿菌、不動(dòng)桿菌和克雷伯桿菌等，由染色體介導(dǎo)。,5. 生物膜（BF）的形成,生物膜是指細(xì)菌吸附于生物材料（氣管插管）或機(jī)體腔道表面，分泌胞外多

18、糖（EPS)、纖維蛋白、脂蛋白等，將自身包繞其中而形成的膜樣物質(zhì)。,相關(guān)耐藥性的最新研究,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,銅綠假單胞菌（ＰＡＥ）的多藥耐藥機(jī)制復(fù)雜，產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶是其重要機(jī)制之一。研究表明，ＴＥＭ、ＯＸＡ－１０、ＣＡＲＢ３種β－內(nèi)酰胺酶基因在PAE中檢出率高。產(chǎn)ＶＩＭ 型金屬β－內(nèi)酰胺酶是醫(yī)院ＰＡＥ耐亞胺培南的主要機(jī)制之一。細(xì)菌外膜孔蛋白ＯｐｒＤ２缺失與ＰＡＥ耐亞胺培南的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。ＰＡＥ對(duì)氨基糖苷類抗菌

19、藥物耐藥是因?yàn)楫a(chǎn)氨基糖苷類修飾酶（ＡＭＥｓ）和作用靶位１６ＳｒＲＮＡ基因突變而致。阿米卡星修飾酶ａａｃ（６′）和核苷轉(zhuǎn)移酶ａｎｔ（２′）較常見。ａａｃ（６′）－Ⅰｂ引起對(duì)阿米卡星、妥布霉素耐藥，ａａｃ（６′）－Ⅱ引起對(duì)慶大霉素、妥布霉素耐藥，ａｎｔ（２′）－Ⅰ引起對(duì)慶大霉素、妥布霉素耐藥。普通組PAE ａａｃ（６′）－Ⅰｂ、ａａｃ（６′）－Ⅱ檢出率為100%，ａｎｔ（２′）－Ⅰ檢出率為52.2％，但銅綠假單胞菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素