銅綠假單胞菌群中的若干稀有耐藥基因篩選及功能研究.pdf

1、目的:
　　本文以高通量測序以及基因組信息分析手段，研究不同年份臨床分離的211株銅綠假單胞菌(PA)攜帶的氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，并通過克隆表達(dá)以及藥敏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其功能，闡明了銅綠假單胞菌耐藥性形成的分子機(jī)制。另外，通過與數(shù)據(jù)庫耐藥性基因相關(guān)同源序列比較分析，發(fā)現(xiàn)本文若干耐藥性基因兩側(cè)可能存在可移動(dòng)DNA元件，并通過PCR產(chǎn)物測序驗(yàn)證可移動(dòng)DNA元件的存在，通過對耐藥基因相關(guān)可移動(dòng)DNA元件的結(jié)構(gòu)分析，為進(jìn)一步研究病原菌

2、耐藥性基因的水平轉(zhuǎn)移導(dǎo)致耐藥性播散提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)菌株:本文以溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床2011-2013年分離得到的211株P(guān)A菌株為研究對象，提取其混合基因組并進(jìn)行solexa測序。
　　2、耐藥性基因參考序列的收集:收集GenBank、耐藥基因數(shù)據(jù)庫耐藥性相關(guān)基因序列，整理并去冗余，最后得到具有已知功能的151條氨基糖苷類耐藥基因序列和81條β-內(nèi)酰胺類耐藥基因序列。
　　3、混合

3、基因組測序耐藥性基因的篩選:通過一些生物信息工具(Blast、Perl、Clustalw、Samtools、GATK、Bwa、SOAP denovo、MEGA)以上述兩類耐藥性基因?yàn)閰⒖夹蛄羞M(jìn)行PA混合基因組測序讀長mapping，分析這些耐藥基因在PA中的分布情況以及豐度差異。根據(jù)mapping結(jié)果選出一些覆蓋度高于0.9，豐度相對低的基因，且鮮有報(bào)道的基因作為靶基因進(jìn)行研究。
　　4、靶基因的克隆和功能測定:設(shè)計(jì)靶基因引物，以

4、單個(gè)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選靶基因陽性PA菌株。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109，提取重組質(zhì)粒并通過雙酶切，最后將靶基因連接入表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)化到工程菌大腸桿菌BL21，在Amp板上篩選出陽性克隆，通過菌落PCR鑒定陽性克隆菌株。然后通過藥敏實(shí)驗(yàn)來測定這些陽性克隆株對22種藥物的MIC值，通過與陰性對照菌的MIC值比較來判斷其耐藥功能。
　　5、耐藥基因相關(guān)可移動(dòng)DNA元件分析:首先用SOAP

5、denove軟件對PA混合基因組短reads進(jìn)行拼接，獲得一些Contigs和scaffolds，對序列進(jìn)行注釋并定位靶基因所在的序列片段，分析靶基因兩側(cè)序列中可能存在的可移動(dòng)DNA元件結(jié)構(gòu)，或以靶基因所在序列片段為咨詢序列，搜索核酸序列數(shù)據(jù)庫，提取數(shù)據(jù)庫相似序列及其兩側(cè)序列，分析靶基因兩側(cè)可能存在的可移動(dòng)DNA元件;根據(jù)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)靶基因相關(guān)的可移動(dòng)DNA元件序列片段的引物，通過PCR產(chǎn)物測序，驗(yàn)證靶基因相關(guān)可移動(dòng)DNA元件在銅綠假

6、單胞菌中的存在。
　　結(jié)果:
　　1.銅綠假單胞菌混合基因組高通量測序結(jié)果產(chǎn)生的短序列reads總數(shù)有70，239，195條，reads的長度均為100nt。將reads mapping到151條氨基糖苷類耐藥基因序列和81條β-內(nèi)酰胺類耐藥基因序列上，最后發(fā)現(xiàn)有25個(gè)氨基糖苷類耐藥基因型和3個(gè)β-內(nèi)酰胺類耐藥基因存在于銅綠假單胞菌中。其中氨基糖苷類耐藥基因豐度最高的基因型為aph(3'）-Ⅱb，豐度有1636.218X，覆

7、蓋度0.9988;豐度最低的基因型是aadA12，豐度有2.2X，覆蓋度80.1％。β-內(nèi)酰胺類耐藥基因豐度最高的基因型為blaGES,豐度有198.75X，覆蓋度1;豐度最低的基因型是blaTEM,豐度有4.24X，覆蓋度0.9605。
　　2.從211株銅綠假單胞菌中，PCR篩選出四株菌。TL1256、TL1257攜帶aph(3')-XV基因型，而兩菌株TL1280、TL1299含有blaGES基因型。
　　3.PCR產(chǎn)

8、物測序結(jié)果分析，TL1256與TL1257中的aph(3'）-XV基因型與參照序列(Y18050)的identity為100％，TL1280與TL1299的blaGES基因與參照序列(HM240862)的identity也為100％。
　　4.對aph(3'）-XV基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)本文分離的aph(3')-XV耐藥性基因與變形菌（WP_019407932.1）、銅綠假單胞菌（WP_033945914.1、WP_034067

9、921.1、WP_034085231.1）、不動(dòng)桿菌(WP_032492579.1)等基因編碼蛋白的親緣關(guān)系很近，因此可以推出aph(3')-XV基因在銅綠假單胞菌、變形菌以及不動(dòng)桿菌之間發(fā)生了水平轉(zhuǎn)移。
　　5.成功將aph(3')-XV基因連接到pET-15b表達(dá)載體，并成功構(gòu)建能表達(dá)目的基因的重組菌pET∷aph(3')-XV/BL21。將blaGES基因連接到pET-28a表達(dá)載體，并成功構(gòu)建能表達(dá)目的基因的重組菌pET∷

10、blaGES/BL21。
　　6.MIC功能驗(yàn)證，TL1280、TL1299中發(fā)現(xiàn)的blaGES基因?qū)︻^孢唑林、氨芐西林、哌拉西林、哌拉他唑、新霉素、卡那霉素的MIC值比對照組高出5個(gè)濃度梯度以上，對頭孢西丁高出3個(gè)梯度，對亞胺培南高出2個(gè)梯度。TL1256、TL1257中發(fā)現(xiàn)的aph(3')-XV基因?qū)敲顾氐腗IC值比對照組高出4個(gè)濃度梯度左右，對新霉素只高出2個(gè)梯度左右。
　　7.醫(yī)院分離的211株銅綠假單胞菌隨機(jī)挑

11、選39株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，對其MIC值結(jié)果分析可知臨床PA對β-內(nèi)酰胺類抗生素存在著廣泛的耐藥性，而對氨基糖苷類特別是慶大、西索米星、小諾米星、奈替米星這些抗生素較為敏感。其中TL1256、TL1257這兩株菌幾乎對所有的藥物都耐藥，MIC值均達(dá)到了256μ g/mL以上;TL1280、TL1299這兩株對大部分的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，MIC值達(dá)到了256μ g/mL以上。
　　8.數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析顯示aph(3')-XV基因可以位于

12、Ⅰ類整合子中，本文對aph(3')-XV基因陽性菌TL1256與TL1257進(jìn)行aph(3')-XV基因相關(guān)的Ⅰ類整合子PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該兩菌的aph(3')-XV基因都存在于這個(gè)Ⅰ類整合子中，此外，我們同事發(fā)現(xiàn)bl aGES-1，aacA4也存在于Ⅰ類整合子中，由此可見，aph(3')-XV等耐藥性基因基因可以通過Ⅰ類整合子來進(jìn)行菌種間的水平轉(zhuǎn)移的。
　　結(jié)論:
　　1.高通量測序技術(shù)和生物信息工具的

13、結(jié)合，能使我們在短時(shí)間內(nèi)測定上百株細(xì)菌的基因組序列，探索基因組序列結(jié)構(gòu)與病原微生物的耐藥性的關(guān)系，對于致病菌中耐藥基因的分布及新基因的發(fā)掘和功能研究起著極為有效的作用。
　　2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分離的銅綠假單胞菌中含有豐富的氨基糖苷類耐藥基因和少量β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，特別是發(fā)現(xiàn)了許多稀有的耐藥性基因，如aadA12、 aadA4、 blaCARB、blaGES。
　　3.本文銅綠假單胞菌TL1256、TL1257中