幽門螺桿菌的培養(yǎng)鑒定及其基因分型方法學(xué)的建立.pdf

1、背景和目的: 幽門螺桿菌(Hp)是目前世界上最常見的人類感染細(xì)菌之一,全球約50﹪左右的人群均感染過Hp,僅次于齲齒,中國(guó)的感染率約為60﹪.大量的研究已經(jīng)表明,Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要致病因素,并與胃癌、胃MALT淋巴瘤的發(fā)生也密切相關(guān).1994年世界衛(wèi)生組織將其列為第一類生物致癌因子.但是在研究中人們發(fā)現(xiàn),并非所有Hp感染者都會(huì)患胃腸疾病,這就說明只有部分Hp與疾病相關(guān),且有可能不同類型的Hp與不同的疾病相關(guān),于是有

2、學(xué)者就開始進(jìn)行Hp型別與疾病關(guān)系的研究.由于Hp是一種表型特征一致、但基因變異很高的細(xì)菌,故表型分型方法的分型效率比較低,許多分子分型方法應(yīng)運(yùn)而生.在這些分子分型方法中,PCR產(chǎn)物分型因其操作簡(jiǎn)單、方便、所需模板量少等優(yōu)點(diǎn)而在實(shí)際中得到廣泛使用.故本研究建立一種直接PCR方法針對(duì)Hp三類主要毒力因子ureA、cagA和vacA基因及vacA基因亞型進(jìn)行綜合分析分型,希望從Hp的基因水平上來探討其與不同上消化道疾病之間的關(guān)系.另外,由于H

3、p生長(zhǎng)條件要求苛刻,培養(yǎng)起來即復(fù)雜又困難,因此本研究還對(duì)Hp的培養(yǎng)及鑒定方法進(jìn)行了一定的摸索. 材料與方法:標(biāo)本來源于在寧波鎮(zhèn)海龍賽醫(yī)院因上消化道癥狀進(jìn)行胃鏡檢查,采取胃竇黏膜,通過對(duì)患者胃竇粘膜組織進(jìn)行增菌、分離培養(yǎng)、挑取可疑菌落涂片鏡檢,并對(duì)其進(jìn)行有關(guān)Hp生化反應(yīng)鑒定;對(duì)分離鑒定的Hp菌株進(jìn)行DNA提取;采用PCR擴(kuò)增特異性u(píng)reA基因鑒定菌株.采用特定引物對(duì)各菌株基因型進(jìn)行PcR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物在2﹪瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳;在

4、凝膠分析系統(tǒng)中觀察電泳并照相.擴(kuò)增產(chǎn)物通過克隆測(cè)序,BLAST同源分析驗(yàn)證. 結(jié)果: 1.本研究146例胃竇粘膜活檢標(biāo)本中,培養(yǎng)鑒定84例Hp陽(yáng)性菌株,培養(yǎng)Hp陽(yáng)性率為57.53﹪. 2.培養(yǎng)鑒定的84例Hp菌株中,ureA基因的陽(yáng)性率10096(84/84),cagA基因的陽(yáng)性率為90.48﹪(76/84),vacA基因的陽(yáng)性率95.24﹪(80/84),cagA、vacA在胃癌中的陽(yáng)性率均較低,與胃炎、消化性

5、潰瘍比較有顯著性差異. 3.PCR產(chǎn)物經(jīng)過BLAST同源分析,PCR鑒定基因型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致. 4.VacAm2基因的陽(yáng)性率為79.76﹪(67/84),vacAmla基因的陽(yáng)性率20.24﹪(17/84),vacAmlb基因8,33﹪(7/84),vacAmlbm24.76﹪(4/84),比較分析各基因組Hp在各疾病組間陽(yáng)性率,vacAm2在胃癌中的陽(yáng)性率最低,與胃炎、消化性潰瘍比較有顯著性差異,vacAm2在消化

6、性潰瘍中的陽(yáng)性率與胃炎比較無顯著性差異,其余3個(gè)vacA基因亞型在胃炎、消化性潰瘍、胃癌陽(yáng)性率比較均無顯著性差異. 5.VacAm2亞型在胃炎、消化性潰瘍的陽(yáng)性率較高(77.78﹪,86.44﹪),與cagA(83.33﹪,96.78﹪)比較差異無顯著性,VacA其他三個(gè)亞型在胃炎、消化性潰瘍的陽(yáng)性率均較低,與cagA比較差異有顯著性 結(jié)論: 1.本試驗(yàn)Hp培養(yǎng)鑒定改良了Hp培養(yǎng)的配方,使得培養(yǎng)更簡(jiǎn)單易行,陽(yáng)性率