結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株的鑒定及分型方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核病是一種對(duì)人類健康及社會(huì)穩(wěn)定構(gòu)成嚴(yán)重威脅的傳染性疾病。中國(guó)是22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,患病人數(shù)居世界第二位,因此結(jié)核病的防治仍是刻不容緩的任務(wù)。由于結(jié)核病具有潛伏感染的特點(diǎn),傳統(tǒng)的流行病學(xué)方法對(duì)于研究結(jié)核病的傳播具有很大局限性。分子流行病學(xué)是分子生物學(xué)與流行病學(xué)研究方法相結(jié)合產(chǎn)生的新興學(xué)科,在研究結(jié)核病傳播規(guī)律方面有著不可替代的優(yōu)勢(shì)。
　　 結(jié)核分枝桿菌中有一類具有相似遺傳背景的北京基因型菌株。這類菌株的分布廣泛,在世界各

2、地都發(fā)現(xiàn)有北京基因型菌株的流行,并造成多次爆發(fā)流行,人們提出北京基因型菌株可能是致病性更強(qiáng)、傳播更迅速以及耐藥形成更容易的一類菌株。目前,根據(jù)北京基因型菌株的定義,需要Spoligotyping分型來(lái)鑒定。但是,另一方面,Spoligotyping僅僅作為鑒定北京基因型菌株又顯得過(guò)于復(fù)雜和繁瑣。2005年,Tsolaki等在對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)了一些長(zhǎng)序列多態(tài)性位點(diǎn)(large sequence polymorphisms,LSP

3、s),其中RD105是指結(jié)核分枝桿菌基因組中的一段缺失區(qū)域(79567-83034bp),在其研究的37株北京基因型菌株中都發(fā)現(xiàn)這段缺失區(qū)域,并提出RD105可以作為北京基因型菌株的分子標(biāo)志。本研究中,我們通過(guò)檢測(cè)RD105與北京基因型菌株的相關(guān)性,評(píng)價(jià)其作為分子標(biāo)志的可行性,在此基礎(chǔ)上建立快速鑒定北京基因型菌株的新方法。
　　 我國(guó)主要流行菌株中具有較多的北京基因型菌株,建立適用于北京基因型菌株的結(jié)核病的分子流行病學(xué)研究方法可

4、以揭示結(jié)核病傳播途徑,從而制定有效結(jié)核病控制策略來(lái)控制結(jié)核病傳播。目前廣泛應(yīng)用IS6110-RFLP對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因型分型,是基因型分型的金標(biāo)準(zhǔn),其分辨率高,但操作復(fù)雜,結(jié)果分析復(fù)雜而困難,使其應(yīng)用受到很大局限。而Spoligotyping分型方法,相對(duì)簡(jiǎn)單,但分辨率低,尤其對(duì)于北京基因型菌株流行的地區(qū),具有相同Spoligotyping指紋圖譜的北京基因型菌株不能進(jìn)一步區(qū)分,往往難以達(dá)到分型目的。利用基因組DNA上特定位點(diǎn)的數(shù)目

5、可變串連重復(fù)序列(variable-number tandem repeat,VNTR)進(jìn)行基因型分型是在真核生物中常用的方法,它在PCR的基礎(chǔ)上提供的結(jié)果是重復(fù)序列的數(shù)目,簡(jiǎn)單明確,易于比較。近來(lái),VNTR基因分型法越來(lái)越受到重視,被認(rèn)為是研究結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)及種系進(jìn)化的有效工具。但是現(xiàn)有的VNTR位點(diǎn)對(duì)于中國(guó)北京基因型菌株的分辨率有限,因此建立一種簡(jiǎn)便、快速、適合中國(guó)北京基因型菌株分型的VNTR分型方法顯得尤為重要?，F(xiàn)在已

6、經(jīng)有越來(lái)越多的研究著重于新的高分辨率位點(diǎn)的研究,但是每種分型方法的評(píng)價(jià)與研究地區(qū)的樣本密切相關(guān)。因此,需要進(jìn)一步找出新的適合我國(guó)菌株分型的VNTR分型方法。本研究通過(guò)文獻(xiàn)檢索收集已發(fā)現(xiàn)的49個(gè)VNTR位點(diǎn),以流動(dòng)人口較少的崇明島收集結(jié)核分枝桿菌臨床評(píng)估VNTR位點(diǎn)的分辨力,篩選對(duì)北京基因型菌株有高分辨力的位點(diǎn),優(yōu)化了2套VNTR位點(diǎn)組合。
　　 結(jié)核病患者在不同的發(fā)病部位或者在同一病程中感染兩種或兩種以上的結(jié)核分枝桿菌菌株,稱為

7、多重感染。多重感染的研究對(duì)藥敏結(jié)果的判斷和治療方案的評(píng)價(jià),對(duì)結(jié)核病的控制策略以及疫苗發(fā)展都有重要意義。VNTR分型可以簡(jiǎn)單快速的鑒定結(jié)核分枝桿菌多重感染。針對(duì)同一病人肺內(nèi)和肺外不同部位的結(jié)核分枝桿菌的多重感染問(wèn)題,我們對(duì)10位病人的肺內(nèi)及肺外結(jié)核菌株,應(yīng)用建立的VNTR基因分型方法對(duì)其進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)所有病人的肺內(nèi)肺外結(jié)核菌株都是相同的。本研究應(yīng)用分子流行病學(xué)的方法,研究結(jié)核分枝桿菌感染患者的多重感染問(wèn)題,對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染及傳播的研究