幽門螺桿菌基因敲除方法的建立及其應用研究.pdf

1、目的：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H.pylori)是一種革蘭氏陰性的微需氧菌，他定植于胃黏膜上皮細胞的表面，以及胃小凹內黏液深層。大量流行病學的研究調查顯示：全世界約有一半的人口中存在H. pylori的感染，它與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤以及胃腺癌等疾病的發(fā)生有關聯(lián)。大量研究也證實，多個H.pylori的毒力因子直接或間接地參與了上述的病理反應，大部分主要集中于研究CagA, VacA

2、, UreB等毒力因子的研究方面，并且在H.pylori致病過程中也可能還存在其他重要的毒力因子。本研究旨在通過建立H. pylori體內基因敲除方法來篩查新的H. pylori致胃病相關蛋白，并對其進行基因改造和分析評價，以及對其致病機制進行進一步研究。
　　 方法與結果：第一部分，我們選擇cagA, hp0596作為候選基因，從H.pylori26695基因組中分別擴增得到此研究所需基因的上下游同源臂，與兩端帶有FRT位點的

3、氯霉素抗性基因片段共同構建突變載體；以突變載體為模板擴增打靶片段，將其轉化入H. pylori26695，在抗生素選擇壓力下，打靶片段和H.pylori菌體基因組發(fā)生同源重組，通過氯霉素抗性篩選得到帶有抗性標記的重組菌轉化子，并通過一系列的實驗建立了在幽門螺桿菌中進行基因打靶的技術方法。確定了實驗研究過程中的幾個關鍵點，如打靶質粒的濃度、高效的電轉化條件、所用抗生素的濃度和突變株的篩選培養(yǎng)方式，建立了相對高效的基因打靶的方法。在此基礎上

4、我們成功地對cagA,hp0596基因進行了敲除，并在基因組水平、RNA水平和蛋白質水平進行了驗證。
　　 第二部分，為避免H. pylori重組菌株對抗生素選擇壓力的依賴，我們利用反選擇標記sacB基因在幽門螺桿菌中建立了無痕敲除系統(tǒng)，即通過體內基因敲除的方式構建了打靶載體，并對其生長表型作了綜合評價分析。具體而言，我們選定ureB基因作為我們進行基因敲除的目標，利用同源重組原理，成功敲除了幽門螺桿菌中ureB基因，并且結合反

5、選擇系統(tǒng)sacB基因的作用，得到不含抗性標記的突變株H.pylori26695(ΔureB)。研究表明與野生菌株相比突變菌株尿素酶的功能缺失，這樣通過正負兩步置換選擇法在幽門螺桿菌中建立了體內基因無痕敲除的方法。
　　 第三部分，構建穿梭載體，實現(xiàn)Salmonella的腸黏附素蛋白在HPSS1株外膜蛋白上的表達。利用λRed系統(tǒng)將穿梭質粒pHH43進行改造，將菌蛻基因genE及其上游的溫度敏感型啟動子和下游的cat抗性基因，通過