應(yīng)用MLVA對中國人群幽門螺桿菌的基因分型研究.pdf

1、目的：
　　 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H. Pylori)是一種螺旋狀、微需氧、革蘭陰性桿菌，定植于人胃黏膜表面。全球約有50％的人口感染H. Pylori，尤其在發(fā)展中國家，其感染率達(dá)50％～70％。
　　 人類是H. Pylori 唯一的天然宿主，大量研究表明H. Pylori 感染與慢性胃炎、消化性潰瘍和胃黏膜相關(guān)組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生密切相關(guān)。人類對H. Pylori 普遍易感,

2、但感染后的癥狀輕重緩急各不相同,表現(xiàn)出明顯的致病性差異，輕者可無癥狀長期攜帶，重者可引起慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍甚至腫瘤。其原因不僅與宿主的遺傳易感性相關(guān)可能更與菌株的毒力強(qiáng)弱相關(guān)。
　　 H. Pylori 有其獨(dú)特的遺傳變異性和種內(nèi)多樣性，等位基因的序列多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它細(xì)菌。目前對H. Pylori 進(jìn)行的基因分型主要依據(jù)幾種與其感染密切相關(guān)的蛋白質(zhì)或管家基因的多態(tài)性，然而這些傳統(tǒng)分型方法都存在著各自的局限性，目前對于H.

3、Pylori的分型方法還沒有一個(gè)公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)。
　　 利用基因組中特定位點(diǎn)上可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeatsequence，VNTR)進(jìn)行基因分型是生物中常用的方法。VNTR位點(diǎn)是細(xì)菌基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)序列在不同菌株間重復(fù)次數(shù)不同，而重復(fù)序列的大小及兩側(cè)的序列高度保守。因此可通過比較VNTR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)的數(shù)目來區(qū)分不同的菌株。多個(gè)VNTR位點(diǎn)的基因分型稱為多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)

4、單元基因分型方法即Multi-VNTR (Multi-locusvariable-number tandem-repeats analysis, MLVA)。
　　 MLVA 具有很高的分辨能力，既可用于流行病學(xué)研究，也可用于分子進(jìn)化學(xué)研究，已廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌的基因分型研究中，然而尚未在H. Pylori中得到應(yīng)用。本研究首先分離培養(yǎng)中國主要地區(qū)與民族的H. Pylori，然后采用MLVA對不同來源的幽門螺桿菌菌株進(jìn)行基因型檢

5、測與分析，研究MLVA在幽門螺桿菌基因分型中的應(yīng)用和MLVA基因型與菌株分離來源的地區(qū)、民族、疾病等之間的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1.對H. Pylori的常規(guī)分離培養(yǎng)方法根據(jù)高原地區(qū)高海拔、低氣壓、低氧含量等環(huán)境特點(diǎn)（西藏拉薩）進(jìn)行改進(jìn)，并將改進(jìn)的分離培養(yǎng)方法（減量法：打開一袋產(chǎn)氣袋（約18克）去除7克后置37℃微需氧環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)；加氧法：向培養(yǎng)盒內(nèi)加入0.224升氧氣以補(bǔ)足高原缺氧量，然后，置37℃微需氧環(huán)境進(jìn)

6、行培養(yǎng)；加壓加氧法：加氧法操作后，將盒蓋頂端的充氣閥與1.01×105KPa的氮?dú)忾y相聯(lián)，氣流穩(wěn)定后關(guān)閉氣閥，置37℃微需氧環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)。）與常規(guī)法（將接種過的培養(yǎng)基放入2.5L培養(yǎng)盒內(nèi)，打開一袋微需氧產(chǎn)氣袋立即放入盒內(nèi)，置37℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)2～5天。）進(jìn)行比較。探討適合高原環(huán)境特點(diǎn)的H. Pylori分離培養(yǎng)方法，收集高原地區(qū)的菌株。同時(shí)用常規(guī)法收集其它7個(gè)不同地區(qū)(北京、重慶、上海、內(nèi)蒙、杭州、石家莊、廣州等)、不同病種(胃癌、消

7、化性潰瘍、慢性胃炎和無癥狀攜帶者)及主要民族(藏族、蒙族、和漢族)的H.Pylori菌株。
　　 2.參照其它細(xì)菌如結(jié)核分枝桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏桿菌等MLVA基因分型的選點(diǎn)原則及H. Pylori基因組自身的特點(diǎn)制定了選點(diǎn)原則如下：①重復(fù)序列的重復(fù)片段≥10bp; ②連續(xù)兩個(gè)重復(fù)片段的堿基突變率≤5％; ③每個(gè)重復(fù)位點(diǎn)在三株參照株之間(26695, H. pyloriAG1, J99)至少存在兩個(gè)等位基因。按照此選點(diǎn)原則

8、篩選VNTR位點(diǎn)并設(shè)計(jì)引物，對不同地區(qū)來源的20株H. Pylori進(jìn)行基因擴(kuò)增，電泳圖譜分析，觀察擴(kuò)增條帶是否存在差異以及差異程度的大小，進(jìn)一步篩選具有較好分辨力的VNTR位點(diǎn)。
　　 3.應(yīng)用篩選的VNTR 位點(diǎn)對不同地區(qū)、不同消化系疾病、不同民族來源的202株H. Pylori菌株進(jìn)行基因擴(kuò)增、電泳,應(yīng)用UVB-紫外凝膠分析儀或Bio-Numerics 5.1分析軟件，讀出各個(gè)擴(kuò)增片段的大小，根據(jù)設(shè)計(jì)引物時(shí)兩端保守序列的大

9、小，每個(gè)重復(fù)單元的長度計(jì)算出各個(gè)重復(fù)片段的重復(fù)次數(shù)。應(yīng)用Bio-Numberics 軟件對重復(fù)次數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和最小生成樹分析，研究MLVA基因型與菌株來源的地區(qū)、民族、疾病之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.建立了適合高海拔、低氣壓、低氧含量等環(huán)境特點(diǎn)的H. Pylori分離培養(yǎng)方法，收集了35株高原地區(qū)（西藏）的H. Pylori菌株。應(yīng)用H. Pylori的常規(guī)分離培養(yǎng)方法收集了廣東和石家莊地區(qū)H. Pyl

10、ori菌株各12株，北京菌株10株，杭州菌株26株，上海菌株10株，內(nèi)蒙菌株43株。與日本東京大學(xué)交換了15株日本H. Pylori菌株，共計(jì)實(shí)驗(yàn)菌株202株。
　　 2.根據(jù)制定的選點(diǎn)原則篩選出了20個(gè)VNTR位點(diǎn)，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定出12個(gè)多態(tài)性較好的位點(diǎn)，分別為VNTR-180，VNTR-263，VNTR-614，VNTR-557，VNTR-607，VNTR-1801，VNTR-2181，VNTR-2457，VNTR-2

11、576，VNTR-5062，VNTR-5282，VNTR-5581。
　　 3.應(yīng)用12個(gè)VNTR位點(diǎn)對202株H. Pylori臨床分離株進(jìn)行了基因分型，取得了較好的分型效果，202株菌株可以完全被鑒別。應(yīng)用Bio-Numberics軟件對重復(fù)次數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和最小生成樹分析，聚類分析結(jié)果顯示，202株菌株聚集成5個(gè)基因亞型，同一個(gè)地區(qū)來源的菌株表現(xiàn)出了相同或相似的基因型，并聚類在一起，表明了來自同一個(gè)地區(qū)的菌株具有明顯的

12、地區(qū)聚集性。對118株4個(gè)不同民族(藏族、蒙族、漢族、大和民族)菌株的VNTR位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了最小生成樹分析，結(jié)果表明，不同來源的菌株在民族間具有明顯的聚集趨勢，四個(gè)民族來源的菌株主要聚集成了4個(gè)亞群，每個(gè)民族主要聚集于一個(gè)亞群。
　　 4.在202株H.pylori臨床菌株中，非潰瘍性消化不良、慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌菌株分別占14.9％, 55.9％, 25.2％和4.0％，在基因型與疾病的相關(guān)性研究中，未發(fā)現(xiàn)與疾病的明