幽門螺桿菌CagA基因克隆及表達(dá).pdf

1、背景與目的：幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病原菌，并與胃癌和胃粘膜相關(guān)性淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。根據(jù)Hp是否含有細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白編碼基因(cytotoxin-associatedproteingeneA，CagA)和空泡毒素相關(guān)蛋白編碼基因(Vacuolatingcytotoxin-associatedproteingeneA，VagA)將Hp分為Ⅰ型菌株(CagA+、VagA+)和Ⅱ型

2、菌株(CagA-、VagA-)兩種。Ⅰ型菌株含有一個(gè)約40kb的特殊基因片段，因其編碼CagA等毒力因子而被稱為cag毒力島。1997年到1998年，2個(gè)HpⅠ型菌株26695菌株和J99菌株的基因組被完全測(cè)序，使人們能夠全面了解HpⅠ型菌株的基因組結(jié)構(gòu)和主要特征。鑒于Ⅰ型菌株現(xiàn)被認(rèn)為是消化道潰瘍和胃腫瘤的重要成因，因此CagA基因的研究成為Hp研究中的熱點(diǎn)。目前，對(duì)于治療Hp感染主要應(yīng)用抗生素和質(zhì)子泵抑制劑，但抗生素的廣泛應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致H

3、p耐藥性的不斷增加，且價(jià)格昂貴，復(fù)發(fā)的機(jī)率較大。因此，預(yù)防Hp的感染十分必要和緊迫。但目前尚未研制出實(shí)用有效的HpⅠ型菌株疫苗。為此，本研究擬利用分子生物學(xué)技術(shù)，建立CagA的原核表達(dá)系統(tǒng)，為Hp重組疫苗的研制提供備選抗原，同時(shí)也為HpⅠ型菌株的鑒定試劑盒提供抗原參考。 方法：根據(jù)GenBank收錄的HpCagA序列，設(shè)計(jì)PCR引物，并在每條引物前分別添加內(nèi)切酶位點(diǎn)。通過(guò)PCR擴(kuò)增Hp菌株的CagA基因，運(yùn)用分子克隆的經(jīng)典方法，

4、用pGEM-TEasy載體攜帶該基因轉(zhuǎn)化工程菌JM109，繼而通過(guò)藍(lán)白實(shí)驗(yàn)篩選出陽(yáng)性菌落并對(duì)該基因進(jìn)行測(cè)序，將其結(jié)果與已公布的CagA基因序列比對(duì)。測(cè)序結(jié)果正確后再將CagA基因從pGEM-TEasy-CagA質(zhì)粒中切出，用表達(dá)載體pGEX-5X-1攜帶該基因轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選和菌落PCR挑選出陽(yáng)性克隆pGEX-5X-1-CagA。而后以IPTG誘導(dǎo)含pGEX-5X-1-CagA的宿主菌表達(dá)融合蛋白，經(jīng)

5、SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白表達(dá)情況，并用Western-blot鑒定融合蛋白的抗原性。 結(jié)果：1.靶基因擴(kuò)增：從Hp菌株中，利用PCR擴(kuò)增得到CagA目的基因(570bp)，加上兩端內(nèi)切酶位點(diǎn)共586個(gè)堿基對(duì)。 2.成功構(gòu)建pGEM-T-CagA原核重組質(zhì)粒，目的CagA基因的測(cè)序結(jié)果均與GenBank公布的同源性達(dá)100％，對(duì)應(yīng)蛋白序列同源性100％。 3.成功構(gòu)建pGEX-5X-1-CagA，并經(jīng)SDS

6、-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果表明，含pGEX-5X-1-CagA的BL21(DE3)宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能表達(dá)出GST-CagA融合蛋白，分子量大小與預(yù)期相一致(48KD)。 4.Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示該融合蛋白可與抗-CagA蛋白結(jié)合反應(yīng)。 結(jié)論：1.成功獲得HP菌株CagA保守區(qū)基因序列，經(jīng)測(cè)序分析其與GenBank上該序列的同源性達(dá)100％。 2.成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-5X-1-Cag