幽門螺桿菌CagA蛋白調(diào)控α-烯醇酶表達(dá)的機(jī)制.pdf

1、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是一種微需氧有鞭毛的螺旋型革蘭氏陰性菌，1982年由Marshall和Warren在人體胃中首次發(fā)現(xiàn)。Hpylori的全球人群感染率超過50％，在發(fā)展中國家感染率更高。H.pylori的感染是慢性胃炎、胃潰瘍等發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，也與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切，胃癌的死亡率在腫瘤相關(guān)疾病死亡率中居第二位。H.pylori致病因子眾多，其中與腫瘤發(fā)生關(guān)系最密切的是細(xì)胞毒素相關(guān)基

2、因致病島（cytotoxin-associated genepathogenicity island，cagPAI），在一半的西方型菌株和90％的東亞型菌株中均攜帶cagPAI。cagPAI中編碼120-140 kDa大小的CagA蛋白與胃癌的發(fā)生有密切關(guān)系。
　　為了闡明CagA蛋白在H.pylori感染導(dǎo)致胃癌的致病機(jī)制中的作用，本課題組構(gòu)建了一株cagA基因敲除的突變菌株HP27（cagA-）;經(jīng)過HP27(cagA-)突變

3、株和野生菌HP27（cagA+）分別感染胃上皮細(xì)胞，利用雙向電泳和質(zhì)譜分析篩選兩組細(xì)菌感染引起的宿主細(xì)胞總蛋白的差異。首次發(fā)現(xiàn):與突變株相比，α-烯醇化酶(ENO1)在野生菌感染組中呈高表達(dá)，提示ENO1的表達(dá)可能與CagA蛋白有關(guān)。ENO1是一種能量代謝關(guān)鍵酶，一些證據(jù)表明ENO1和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，ENO1的高表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的無限增殖過程，例如在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺癌、肝癌和胃腸道腫瘤中ENO1都呈高表達(dá)。因此

4、ENO1被認(rèn)為是一種新的腫瘤相關(guān)蛋白。
　　但目前，CagA蛋白對宿主細(xì)胞ENO1表達(dá)的調(diào)控研究未見報(bào)道。因此本研究通過構(gòu)建CagA真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系，探討CagA蛋白是否上調(diào)細(xì)胞ENO1蛋白的表達(dá);利用CagA去磷酸化突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，研究CagA蛋白磷酸化在CagA誘導(dǎo)ENO1高表達(dá)中的作用;最后，利用信號蛋白抑制劑研究CagA蛋白是通過哪些信號通路介導(dǎo)ENO1表達(dá)的調(diào)控。
　　目的:
　　通過研究CagA

5、蛋白對胃癌細(xì)胞ENO1蛋白表達(dá)的調(diào)控及其信號通路，探討CagA蛋白在H.pylori感染導(dǎo)致胃癌發(fā)生中的作用。為進(jìn)一步闡明H.pylori感染所致胃癌的分子機(jī)制和胃癌防治提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、提取HP27全基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增得到cagA基因(QD306710)，并與pMD19-T載體連接;
　　2、分別雙酶切cagA基因和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，并進(jìn)行定向連接，構(gòu)建cagA基因真核表

6、達(dá)載體pcDNA3.1-WT-cagA(pWT-cagA)，挑取陽性單克隆進(jìn)行PCR、酶切和測序鑒定;
　　3、采用重疊延伸法PCR進(jìn)行cagA基因的點(diǎn)突變，構(gòu)建CagA蛋白的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)突變載體PRCagA(B-)和PRCagA(D-)，挑取陽性單克隆進(jìn)行測序鑒定;
　　4、利用幽門螺桿菌野生株感染胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和SGC-7901，利用實(shí)時定量熒光PCR和Werstern-blot方法檢測感染細(xì)胞前后的ENO1 mR

7、NA和蛋白的表達(dá)變化。
　　5、將cagA基因真核表達(dá)載體pWT-cagA和空載體pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，培養(yǎng)36 h后，空質(zhì)粒組為對照，利用實(shí)時定量熒光PCR和Werstern-blot方法檢測轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞ENO1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　6、突變表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-PRB-cagA（PRCagAB-）和pcDNA3.1-PRD-cagA(PRCagAD-)轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，培養(yǎng)36h后，空

8、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為對照，利用實(shí)時定量熒光PCR和Werstern-blot方法檢測轉(zhuǎn)染后三組細(xì)胞ENO1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平改變情況。
　　7、用四種特異性信號蛋白抑制劑來檢測與CagA介導(dǎo)的ENO1上調(diào)有關(guān)的信號通路。用BAY11-7082阻斷NF-κB激酶活性，LY294002阻斷PI3K激酶活性，PP1阻斷Src家族激酶活性，U0126阻斷ERK1/2激酶活性，預(yù)處理AGS細(xì)胞1h，再分別用pWT-cagA和空載體pcDNA

9、3.1(+)轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞總蛋白，用Werstern-blot方法檢測ENO1蛋白的表達(dá)水平改變情況。
　　結(jié)果:
　　1、成功擴(kuò)增cagA基因，基因編碼區(qū)全長為3510 bp，成功構(gòu)建pDM19-T-cagA質(zhì)粒;
　　2、經(jīng)PCR、酶切和測序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了CagA蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-WT-cagA(pWT-cagA);
　　3、成功構(gòu)建CagA蛋白的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)突

10、變載體PRCagA(B-)和PRCagA(D-)，測序結(jié)果顯示EPIYA基序中的酪氨酸密碼子TAC被定點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼崦艽a子TGC;
　　4、幽門螺桿菌感染胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞，均能在mRNA和蛋白水平上調(diào)ENO1的表達(dá);
　　5、pWT-cagA（CagA組）和空質(zhì)粒pcDNA3.1（對照組）分別轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后，CagA轉(zhuǎn)染組較對照組ENO1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高;
　　6、用兩個

11、磷酸化位點(diǎn)突變后的PR-CagA表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒pcDNA3.1（對照組）分別轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)三組ENO1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明CagA的磷酸化參與上調(diào)ENO1的表達(dá)。
　　7、用特異性信號蛋白抑制劑預(yù)處理AGS細(xì)胞，Werstern-blot方法檢測ENO1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Src激酶抑制劑(PP1)和ERK通路抑制劑(U0126)能夠抑制CagA誘導(dǎo)的ENO1表達(dá)的增加，而NF-κB通

12、路抑制劑(BAY11-7082)和PI3激酶抑制劑(LY294002)不能抑制CagA介導(dǎo)的ENO1表達(dá)的上調(diào)，顯示Src和ERK通路參與CagA對ENO1上調(diào)的過程。
　　結(jié)論:
　　1、H.pylori感染能夠上調(diào)胃癌細(xì)胞中ENO1 mRNA和蛋白水平的表達(dá);
　　2、H. pylori感染上調(diào)胃癌細(xì)胞ENO1蛋白的表達(dá)是依賴于細(xì)菌的細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白CagA;
　　3、CagA蛋白介導(dǎo)的ENO1表達(dá)上調(diào)有賴于