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文檔簡(jiǎn)介
1、一般認(rèn)為,Helicobacter pylori(H.pylori)致胃癌的發(fā)病機(jī)理是由其觸發(fā)的炎癥引起的胃萎縮、腸上皮化生、異型增生并最終發(fā)展成腺癌的一個(gè)多級(jí)發(fā)展過(guò)程。H.pylori感染引起胃炎和胃萎縮,是促成癌前病變和最終導(dǎo)致胃癌的重要因素。機(jī)體對(duì)于H.pylori感染能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答,但是并不能完全有效地清除H.pylori。H.pylori對(duì)宿主的毒性作用、免疫逃逸作用以及宿主對(duì)H.pylori的殺滅清除作用存在著有機(jī)的動(dòng)態(tài)平
2、衡,但這種平衡的分子機(jī)制尚不明確。
非編碼RNA,即不能編碼蛋白質(zhì)的RNA,包括核糖體RNA(rRNA),轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA),小干擾RNA(siRNA),核內(nèi)小RNA(snRNA),核仁小RNA(small nuclear RNA,snoRNA),微小RNA(microRNA),piwi相互作用RNA(piwi-interacting RNAs,piRNA)及長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncR
3、NA)等多種RNA,其中大部分RNA的功能是已知的,但也有相當(dāng)一部分的RNA類型,具有特殊的結(jié)構(gòu),其功能也沒(méi)有得到廣泛的研究。這些RNA的共同特點(diǎn)是都能從基因組上轉(zhuǎn)錄而來(lái),但是不翻譯成蛋白,在RNA水平上就能行使各自的生物學(xué)功能了。從不同層面調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA,根據(jù)分子長(zhǎng)度劃分為microRNA及l(fā)ncRNA。目前約有8000多種miRNA得到鑒定,其中1500多種microRNA在哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)。在人類基因組中已經(jīng)明確標(biāo)定的
4、lncRNA有9640種。microRNA是一類帶有18-24個(gè)核苷酸的RNA,影響多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),在炎癥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和變異中起著重要作用。lncRNA在近年的研究中得到了極大的關(guān)注,越來(lái)越多的學(xué)者和實(shí)驗(yàn)室致力于研究其結(jié)構(gòu)和功能。大多數(shù)的lncRNA參與了基因印生物學(xué)功能包括基因印記、染色體修飾、蛋白質(zhì)結(jié)合與干擾等,也有部分lncRNA行使其功能與microRNA相類似,通過(guò)激活或干擾轉(zhuǎn)錄本,實(shí)現(xiàn)對(duì)某個(gè)特定蛋白的靶向激活或
5、抑制。同時(shí),還有大量的lncRNA尚未知其功能。
本研究通過(guò)H.pylori感染人胃上皮細(xì)胞模型,利用全基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)H.pylori感染前后胃上皮細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜變化,結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR,對(duì)差異lncRNA進(jìn)行篩選與鑒定。選取差異表達(dá)最明顯的XLOC_004122和XLOC_014388,檢測(cè)其在臨床H.pylori感染組織樣本的表達(dá)特性,并探討其與致腫瘤預(yù)后指標(biāo)是否存在相關(guān)性。同時(shí),針對(duì)同樣差異表達(dá)的micro
6、RNA-146a和microRNA-99b,通過(guò)靶點(diǎn)鑒定和功能分析等手段,深入研究其調(diào)控H.pylori感染的分子機(jī)制。
本研究論文分為三部分:(一)幽門螺桿菌侵襲胃上皮細(xì)胞引起的長(zhǎng)鏈非編碼RNA差異表達(dá)分析;(二)microRNA-146a靶向COX-2調(diào)控H.pylori引起胃癌細(xì)胞凋亡的研究;(三)microRNA-99b在胃癌上皮細(xì)胞中通過(guò)調(diào)控自噬發(fā)生抑制H.pylori感染及細(xì)胞增殖作用研究。
第一部分幽門
7、螺桿菌侵襲胃上皮細(xì)胞引起的長(zhǎng)鏈非編碼RNA差異表達(dá)分析
本部分利用H.pylor感染人胃上皮GES-1細(xì)胞24小時(shí)后,提取細(xì)胞的totalRNA,利用全基因組測(cè)序手段,篩選鑒定差異表達(dá)的lncRNA分子;收集臨床病人胃上皮組織樣本,應(yīng)用Realtime RT-PCR技術(shù)檢測(cè)lncRNA分子在H.pylor感染病人和非感染病人中的表達(dá)規(guī)律,探討lncRNA分子在H.pylor致癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其在臨床預(yù)后判斷中的應(yīng)用意義。同
8、時(shí),利用GO分析及基因共表達(dá)分析等生物信息學(xué)分析手段,探索差異lncRNA的生物學(xué)功能。
結(jié)果顯示,H.pylori感染引起GES-1細(xì)胞一系列非編碼RNA的表達(dá)改變,其中表達(dá)上調(diào)的有24條lncRNA,表達(dá)下調(diào)的有22條lncRNA。其中五條lncRNA,XLOC_004562(P<0.05), XLOC_005912, XLOC_000620, XLOC_004122(p<0.05)和XLOC_014388(p<0.05)
9、的表達(dá)差異最顯著,并已被PCR結(jié)果證實(shí)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),XLOC_004122和XLOC_014388在臨床H.pylori感染的組織樣本中顯著差異表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且與腸化生現(xiàn)象成線性相關(guān)性(p<0.05)。這提示這兩段基因在臨床治療及預(yù)后方面可能存在標(biāo)志物的功能。GO分析和共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),XLOC_004122共表達(dá)主要包括膜蛋白組份、跨膜蛋白、離子通道等相應(yīng)功能的基因,這說(shuō)明XLOC_004122可能參與H.pylori被細(xì)胞胞
10、吞的過(guò)程;XLOC_014388共表達(dá)的豐要包括細(xì)胞間的信號(hào)傳遞、激酶活性、神經(jīng)發(fā)育等功能的基因。本工作意義在于我們可能發(fā)現(xiàn)了治療H.pylori感染及預(yù)防其癌變的新方法,有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
第二部分 microRNA-146a靶向COX-2調(diào)控H.pylori引起胃癌細(xì)胞凋亡的研究
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向H.pylori感染的胃癌細(xì)胞MKN7轉(zhuǎn)染microRNA-146a mimics和inhibitor,建立micro
11、RNA-146a過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)的細(xì)胞模型,利用V-Fluosstaining kit(凋亡檢測(cè)試劑盒)測(cè)定細(xì)胞凋亡率,結(jié)合凋亡正相關(guān)標(biāo)志物Bax和負(fù)相關(guān)標(biāo)志物Bcl2的表達(dá),確定microRNA-146a是否可以影響癌細(xì)胞的發(fā)生并深入探討microRNA-146a對(duì)癌細(xì)胞的凋亡發(fā)生影響是否通過(guò)抑制靶基因COX-2實(shí)現(xiàn)。同時(shí),檢測(cè)胃癌臨床樣本中,microRNA-146a表達(dá)與凋亡發(fā)生率的相關(guān)性,并分析microRNA-146a與腫瘤預(yù)
12、后的相關(guān)性。
結(jié)果顯示;H.pylori感染的癌細(xì)胞模型和臨床樣本中,microRNA-146a表達(dá)(p<0.05)和細(xì)胞凋亡發(fā)生率(p<0.05)均顯著高于H.pylori陰性對(duì)照組;microRNA-146a過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞較對(duì)照組凋亡率顯著升高(p<0.05),且凋亡正相關(guān)分子Bax顯著上調(diào)(p<0.05),負(fù)相關(guān)分子Bcl2顯著下調(diào)(p<0.05);在此細(xì)胞模型中,對(duì)COX-2的過(guò)表達(dá)可抑制microRNA-146a對(duì)
13、凋亡的上調(diào)作用(p<0.05),說(shuō)明microRNA-146a對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控是通過(guò)靶向抑制COX-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步的臨床樣本分析發(fā)現(xiàn),microRNA-146a與腫瘤組織細(xì)胞凋亡率正相關(guān),且與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明microRNA-146a可能通過(guò)調(diào)控COX-2表達(dá),促進(jìn)凋亡,進(jìn)而抑制H.pylori感染引起的胃癌發(fā)生。本項(xiàng)工作的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步闡明H.pylori感染的致癌發(fā)生機(jī)制以及機(jī)體對(duì)H.
14、pylori的致癌作用調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供新的方向。
第三部分 microRNA-99b在胃癌上皮細(xì)胞中通過(guò)調(diào)控自噬發(fā)生抑制H.pylori感染及細(xì)胞增殖作用研究
本實(shí)驗(yàn)在H.pylori感染的胃癌細(xì)胞模型和臨床樣本中,檢測(cè)microRNA-99b的表達(dá);通過(guò)向H.pylori感染的胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染microRNA-99b mimics和inhibitor,建立microRNA-99b過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)的細(xì)胞模型,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H
15、.pylori菌荷菌量的變化;利用Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ,轉(zhuǎn)染GFP-LC3并利用激光共聚焦技術(shù)對(duì)LC3進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù),從而判定microRNA-99b是否可以調(diào)控自噬發(fā)生;同時(shí),利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)microRNA-99b的靶基因,并通過(guò)靶基因熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),鑒定microRNA-99b的靶基因,并分析microRNA-99b調(diào)控自噬的分子機(jī)制是否通過(guò)抑制靶基因?qū)崿F(xiàn)的。
結(jié)果顯示,H.pyl
16、ori感染的胃癌細(xì)胞模型和臨床樣本中,microRNA-99b表達(dá)(p<0.05)顯著高于H.pylori陰性對(duì)照組;microRNA-99b過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)H.pylori的殺菌作用強(qiáng)于對(duì)照組,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);Western blot結(jié)果顯示,LC3分子由LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化,說(shuō)明microRNA-99b過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生,對(duì)LC3斑點(diǎn)計(jì)數(shù)也印證了這一點(diǎn)(p<0.05);利用targetscan軟件
17、預(yù)測(cè)到microRNA-99b的靶基因?yàn)閙TOR。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了microRNA-99b確實(shí)能與mTOR的3’-UTR結(jié)合;Western blot結(jié)果表明,microRNA-99b通過(guò)抑制mTOR蛋白表達(dá)促進(jìn)自噬的發(fā)生。
結(jié)論:
綜合本文的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)數(shù)據(jù),我們提出以下結(jié)論:
1.篩選鑒定出H.pylori感染引起的差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,并發(fā)現(xiàn)XLOC_004122和XLOC_014388
18、在臨床H.pylori感染的組織樣本中顯著差異表達(dá),且與腸化生現(xiàn)象成線性相關(guān)性。提示這兩段基因在臨床治療及預(yù)后方面可能存在標(biāo)志物的功能。
2.發(fā)現(xiàn)microRNA-146a在H.pylori感染中調(diào)控細(xì)胞的凋亡和癌變,并證實(shí)是通過(guò)靶向COX-2實(shí)現(xiàn)此功能。microRNA-146a也與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移正相關(guān)。
3.發(fā)現(xiàn)microRNA-99b在H.pylori感染中刺激細(xì)胞自噬發(fā)生并因此上調(diào)細(xì)胞殺菌能力。此功能是通過(guò)靶
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