弓形蟲自噬蛋白8(ATG8)、ATG3的多抗制備及ATG7-HA轉(zhuǎn)基因蟲株構(gòu)建.pdf

1、細(xì)胞自噬(autophagy)是一種真核生物中普遍存在的細(xì)胞生物學(xué)行為，是將細(xì)胞內(nèi)衰老的蛋白質(zhì)或損失的細(xì)胞器進(jìn)一步降解回收的代謝過程。它不僅維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的分化和發(fā)育，還在營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)幫助細(xì)胞緩解饑餓壓力。
　　剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種呈世界性分布的廣泛存在于人和動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的寄生原蟲，它能感染幾乎所有有核細(xì)胞，而且感染效率很高，可引起嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，即弓形蟲病(toxoplasmosi

2、s)，對(duì)孕婦、免疫抑制或免疫缺陷病人以及動(dòng)物的影響尤為嚴(yán)重，可導(dǎo)致其死亡。目前對(duì)弓形蟲病的治療仍以化學(xué)藥物為主，如乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、乙酰螺旋霉素、阿托伐醌等，但大量體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)這些藥物并不能完全殺滅宿主體內(nèi)的病原體，甚至使疾病轉(zhuǎn)為隱形感染階段，而研究發(fā)現(xiàn)自噬與弓形蟲的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，故調(diào)控自噬可能成為治療弓形蟲病的新方向。
　　本實(shí)驗(yàn)通過Blast軟件與自噬研究較為深入的酵母自噬相關(guān)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)序列相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)

3、，剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）體內(nèi)存在著三個(gè)高度同源的自噬相關(guān)蛋白，分別是TgATG8(Toxoplasma gondii autophagy-related geneprotein8，TgATG8)、TgATG3及TgATG7。透射電鏡證明弓形蟲體內(nèi)自噬現(xiàn)象的存在。為了進(jìn)一步研究弓形蟲自噬機(jī)制以及這三個(gè)蛋白的功能，通過分子克隆的方法分別構(gòu)建TgATG8及TgATG3原核表達(dá)質(zhì)粒，利用表達(dá)的相應(yīng)重組蛋白制備了兔抗Tg

4、ATG8多克隆抗體及兔抗TgATG3多克隆抗體，與此同時(shí)，還利用不依賴連接酶的克隆方法(Ligation-independent cloning，LIC)構(gòu)建pLIC-TgATG7-HA質(zhì)粒，經(jīng)電轉(zhuǎn)及同源重組單交叉原理獲得了ATG7-HA轉(zhuǎn)基因蟲株，這些抗體及轉(zhuǎn)基因蟲株都將成為弓形蟲自噬機(jī)制研究的有利工具。
　　目的：
　　制備特異性抗TgATG8多克隆抗體及特異性抗TgATG3多克隆抗體，構(gòu)建ATG7-HA轉(zhuǎn)基因蟲株，用于

5、弓形蟲自噬機(jī)制研究。
　　方法：
　　1.生物信息學(xué)方法分析弓形蟲基因組中自噬相關(guān)蛋白的基因序列和氨基酸序列。
　　2.透射電鏡觀察自噬前后弓形蟲超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　3.弓形蟲抗ATG8多克隆抗體的制備
　　3.1以弓形蟲RH株cDNA為模板，常規(guī)分子克隆方法構(gòu)建pGEX-6p-1-TgATG8重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌（Escherichia coli）BL21。
　　3.2經(jīng)異丙基-β-D-硫代

6、半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽親和層析法純化表達(dá)產(chǎn)物。
　　3.3以純化的TgATG8蛋白作為抗原免疫日本大耳白兔，獲得特異性抗TgATG8多克隆抗體。
　　3.4以制備的多克隆抗體作為一抗進(jìn)行Western blotting與IFA檢測(cè)。
　　4.弓形蟲抗ATG3多克隆抗體的制備
　　4.1以弓形蟲RH株cDNA為模板，常規(guī)分子克隆方法構(gòu)建pET28a-TgATG3重組質(zhì)粒，

7、轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌(Escherichiacoli)Rosatte。
　　4.2經(jīng)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，用鎳柱親和層析法純化表達(dá)產(chǎn)物。
　　4.3以純化的TgATG3蛋白作為抗原免疫日本大耳白兔，獲得特異性抗TgATG3多克隆抗體。
　　4.4以制備的多克隆抗體作為一抗進(jìn)行Western blotting與IFA檢測(cè)。
　　4.5收集自噬誘導(dǎo)前后的GFP-ATG8蟲株，與抗GFP Beads免疫共沉淀后保留上清，以

8、制備的多克隆抗體作為一抗對(duì)上清中ATG3蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。
　　5.ATG7-HA轉(zhuǎn)基因蟲株的構(gòu)建
　　5.1以弓形蟲RH株DNA為模板，利用LIC方法構(gòu)建pLIC-TgATG7-HA質(zhì)粒。
　　5.2將質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染弓形蟲，乙胺嘧啶篩選陽性單克隆。
　　5.3 IFA和Western blotting鑒定新蟲株構(gòu)建成功。
　　結(jié)果：
　　1.序列相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，剛地弓形

9、蟲體內(nèi)存在著TgATG8、TgATG3及TgATG7這三個(gè)高度同源的自噬相關(guān)蛋白。
　　2.透射電鏡發(fā)現(xiàn)自噬誘導(dǎo)后弓形蟲胞漿內(nèi)有自噬體(autophagosomes，Ap)樣結(jié)構(gòu)和自噬降解泡樣結(jié)構(gòu)(autophagic degradative vacuoles，Av)存在。
　　3.測(cè)序結(jié)果證實(shí)原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-TgATG8構(gòu)建成功。Western blotting結(jié)果證實(shí)，所制備的多克隆抗體能特異性識(shí)別蟲株體

10、內(nèi)天然的TgATG8蛋白。IFA實(shí)驗(yàn)表明，TgATG8均勻分布于蟲體胞漿中，但在自噬誘導(dǎo)培養(yǎng)16h后，TgATG8逐漸聚集成顆粒狀。
　　4.測(cè)序結(jié)果證實(shí)原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-TgATG3構(gòu)建成功。Western blotting結(jié)果證實(shí)，所制備的多克隆抗體能特異性識(shí)別蟲株體內(nèi)天然的TgATG3蛋白。IFA結(jié)果表明TgATG3分布于蟲體胞漿中。與抗GFP-Beads免疫共沉淀后，自噬誘導(dǎo)組上清中無TgATG3蛋白信號(hào)。

11、　　5.測(cè)序結(jié)果證實(shí)pLIC-TgATG7-HA質(zhì)粒構(gòu)建成功。IFA實(shí)驗(yàn)表明，ATG7-HA轉(zhuǎn)基因蟲株體內(nèi)可見綠色熒光。利用抗HA抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)在目的大小有特異性識(shí)別。
　　結(jié)論：
　　弓形蟲體內(nèi)有自噬現(xiàn)象的存在，本實(shí)驗(yàn)制備的弓形蟲抗ATG8多克隆抗體及抗ATG3多克隆抗體均能特異性識(shí)別內(nèi)源性TgATG8蛋白及TgATG3蛋白，ATG7-HA轉(zhuǎn)基因蟲株構(gòu)建成功，為進(jìn)一步進(jìn)行弓形蟲自噬研究奠定了實(shí)