弓形蟲GJS株微線體蛋白3基因的克隆、表達(dá)及鑒定.pdf

1、弓形蟲(Toxoplasma gondii)為專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，呈全球分布，引起的弓形蟲病是一種嚴(yán)重的人獸共患的寄生蟲病，對人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害。弓形蟲病診斷方法和免疫疫苗已成為弓形蟲研究的當(dāng)務(wù)之急。微線體蛋白3(Microneme protein3 MIC3)為弓形蟲生活史各期均分泌的抗原，具有高度的保守性和免疫原性，作為疫苗候選因子受到人們的關(guān)注。 根據(jù)已發(fā)表的弓形蟲RH株MIC3的基因序列設(shè)計引物，利用PC

2、R技術(shù)從弓形蟲GJS株基因組中擴(kuò)增到MIC3基因，通過將產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-MIC3。基因測序結(jié)果表明，本試驗所獲得的MIC3基因核苷酸序列和所編碼氨基酸的序列與GenBank中收錄的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒RH株的同源性分別為99.7％和99.2％。根據(jù)MIC3開放閱讀框(ORF)序列重新設(shè)計一對去掉信號肽編碼序列的引物，以重組質(zhì)粒pMD-MIC3為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pET-30a表達(dá)質(zhì)粒連接，構(gòu)建了重組

3、原核表達(dá)載體pET-MIC3，將其轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，所表達(dá)的目的蛋白為包涵體。SDS-PAGE和Western-blot分析表明，MIC3基因在大腸桿菌中以包涵體的形式成功獲得了表達(dá)，分子量大小為44 ku左右，與預(yù)期的大小一致，而且可被豬抗弓形蟲陽性血清所識別。通過裂解、洗滌、變性、復(fù)性等方法對包涵體蛋白進(jìn)行處理，以電泳切膠回收所獲得的純化產(chǎn)物作為抗原，免疫小鼠制備抗重組蛋白血清。用弓形蟲代謝分