自噬復(fù)合體ATG5-ATG12促進(jìn)Ⅰ型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)口蹄疫病毒復(fù)制的影響.pdf

1、口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)感染偶蹄類(lèi)動(dòng)物所引發(fā)的一種急性烈性傳染病。天然免疫作為機(jī)體抗病毒感染的第一道防線(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體通過(guò)識(shí)別病毒核酸或病毒產(chǎn)物，激活一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)、誘導(dǎo)I型干擾素和抗病毒因子的產(chǎn)生，最終實(shí)現(xiàn)抗病感染效果。
　　細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的一種重要的生命活動(dòng)，是細(xì)胞內(nèi)主要依賴(lài)于溶酶體的一

2、種降解途徑，通過(guò)將機(jī)體不需要的生物大分子包裹形成自噬體，并與溶酶體融合從而將內(nèi)容物降解，自噬與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，自噬也具有清除病原體的功能，這一功能通常與天然免疫密切相關(guān)，最終抵御病原微生物的感染。ATG5-ATG12復(fù)合物是自噬過(guò)程中的重要復(fù)合體，在自噬體膜的延伸過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，自噬的許多功能與ATG5有關(guān)，下調(diào)ATG5-ATG12能有效阻斷自噬，而且發(fā)現(xiàn) ATG5參與調(diào)控 I型干擾素的表達(dá)。因此，研究自噬蛋白復(fù)合物 AT

3、G5-ATG12抗病毒的作用機(jī)制，將為抗病毒藥物的研制和疫苗的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
　　先前有研究表明 FMDV可激活細(xì)胞自噬，本研究將根據(jù)這一現(xiàn)象進(jìn)一步追蹤口蹄疫病毒誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制以及自噬復(fù)合體ATG5-ATG12與天然免疫的調(diào)控關(guān)系。首先為了確定口蹄疫病毒是否能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞系豬腎傳代細(xì)胞(PK-15)細(xì)胞的自噬以及自噬復(fù)合體 ATG5-ATG12的誘導(dǎo)表達(dá)情況，選擇PK-15為研究對(duì)象，通過(guò)共聚焦激光顯微鏡技術(shù)和蛋白免疫印跡

4、（Western blot）方法確定了自噬標(biāo)志蛋白 LC3-II/LC3-I的變化并檢測(cè)了ATG5-ATG12蛋白的表達(dá)水平隨FMDV感染的的規(guī)律；為了進(jìn)一步確定自噬復(fù)合體ATG5-ATG12是否促進(jìn)細(xì)胞抗病毒天然免疫，通過(guò)過(guò)表達(dá)ATG5-ATG12，分別利用Western blot、熒光定量PCR和TCID50試驗(yàn)，從蛋白、基因及病毒滴度等不同水平確定FMDV復(fù)制與ATG5-ATG12的關(guān)系，隨后進(jìn)一步利用Western blot和熒

5、光定量PCR分析細(xì)胞因子及炎癥因子IFN-β、IL-6、CXCL10、PKR和MX1的表達(dá)情況；為了證實(shí)ATG5-ATG12是否通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)進(jìn)一步調(diào)節(jié)I型干擾素的轉(zhuǎn)錄，通過(guò)過(guò)表達(dá)ATG5-ATG12或抑制ATG5-ATG12表達(dá)的方法，以Western blot檢測(cè)I型干擾素通路的關(guān)鍵分子NF-κB/p65的表達(dá)水平，IκBα的磷酸化水平以及降解水平等，并進(jìn)一步通過(guò)共聚焦激光顯微鏡追蹤p65在細(xì)胞中的定位。
　　結(jié)果顯示

6、，口蹄疫病毒能夠誘導(dǎo) PK-15細(xì)胞的自噬以及自噬復(fù)合體 ATG5-ATG12的表達(dá)， ATG5-ATG12的過(guò)表達(dá)能抑制FMDV的復(fù)制，這一抑制現(xiàn)象是通過(guò)ATG5-ATG12促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路并進(jìn)一步促進(jìn)IFN-β的表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)的。以上結(jié)果在豬腎細(xì)胞（IBRS-2）中有相似結(jié)果，但在I型干擾素缺陷的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）中，ATG5-ATG12并不能抑制FMDV的復(fù)制，這從另一角度證實(shí)，ATG5-ATG12通過(guò)促進(jìn)I型干擾素